目的：脓毒症(Sepsis)是由感染引起的全身性炎症反应综合征(SIRS)，进一步发展可导致脓毒性休克(Septic shock)，是指由脓毒症诱导的组织低灌注和心血管功能障碍。脓毒症时常诱发不同程度的心功能障碍，而心功能障碍的发生又反过来促进了脓毒症的进展和恶化，常常是导致死亡的重要原因。目前对脓毒症时心功能障碍提出了许多可能机制，主要包括以下几点：心肌细胞缺氧造成氧化磷酸化脱耦联，使心肌细胞产生高能磷酸盐的能力下降；内毒素对心肌的直接毒性作用；通过降低心肌细胞的收缩力和减少氧耗来维持基本ATP水平的心肌冬眠；一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的变化导致的心肌收缩舒张功能障碍；TNF-α等炎症介质导致的心肌毒性作用；钙离子通道变化对心肌收缩舒张功能的影响；心肌细胞凋亡及自噬；其他，如:性别、遗传、年龄等因素。近年来，心肌细胞自噬的发生引起广泛关注，自噬是以细胞质空泡化为特征的溶酶体依赖性降解途径。它是体内长寿蛋白的降解途径，也是唯一的一个降解退化细胞器的方式。尤其在心血管疾病发生时自噬究竟如何变化、起到何种作用更是引起重视。细胞自噬是真核细胞特有的，一种相对保守的亚细胞代谢途径，其可作为细胞保持稳定状态的管家机制，调控过氧化物酶体、线粒体和内质网的不断更新，还能清除胞质内受损的细胞器和代谢产物，进行亚细胞水平的重构，保护受损细胞提供能量。然而，也有研究发现细胞自噬的过度激活则会导致细胞程序性死亡，即Ⅱ型程序性细胞凋亡，从而引起一系列疾病或加速疾病的进程。程序性细胞死亡具有可调控性，减少程序性细胞死亡的发生有可能做到，因此目前研究程序性细胞死亡及其与疾病的关系变得尤为重要。自噬在维持心肌细胞稳态，无论结构还是功能方面都有重要作用。正常心肌存在低水平的自噬，基础状态下心脏的自噬对心肌细胞具有保护作用，并对心血管功能有促进作用。同时也有观点认为，自噬在心脏疾病中发挥损伤作用，过度自噬可能导致心肌细胞死亡，而在已经死亡的心肌细胞中发现存在大量自噬体。自噬究竟是导致心肌受损的原因之一还是当心脏损伤或应激后发生的代偿性修复反应，目前尚未形成统一的意见，但不可否认的是，自噬是心脏疾病的一个关键调节因子。因此，想要探究心肌细胞自噬活性变化的机制，就需要我们掌握更多自噬活性变化的时程信息以及了解心脏在不同应激条件下的自噬效应和变化程度。已经有大量研究表明，脓毒症时心肌细胞凋亡可能参与了心肌功能障碍的发生，基于上述的研究现状，我们提出假设:脓毒症休克不同阶段的心功能障碍是否也有自噬的参与？自噬在脓毒症心肌功能障碍中到底扮演了何种角色，是通过不断产生新的能量物质保护心肌细胞免受损害还是通过对自身的降解使心肌细胞损害加重呢？本研究分别以LPS致脓毒性休克大鼠及LPS诱导的H9c2心肌细胞株为对象，观察心肌细胞自噬水平及心肌收缩舒张功能的变化情况，并在细胞水平通过分别给与自噬的激动剂及抑制剂来观察其对心肌收缩舒张功能的影响，我们还通过慢病毒转染技术来初步探讨自噬对心肌收缩舒张功能变化的可能作用机制。　　方法：⑴采用LPS静脉给药的方法建立大鼠脓毒症模型。SPF级Wistar大鼠采用随机数法分为给药后2h、4h、6h，每个时间点对应相应的对照组，共6组，每组8只，实验前正常进食及饮水。20％乌拉坦溶液5ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，剪开左侧腹股沟皮肤，逐层钝性分离左侧股动脉并置管，通过三通头与Biopac多导电生理记录仪压力换能器连接监测平均动脉压(MAP);同法右侧暴露股静脉，用于经股静脉给药，待大鼠左心室插管成功稳定15min后泵入LPS20mg/kg(溶于0.2ml液体)，泵速为0.1ml/min，当MAP较基础值降低25-30％时视为脓毒性休克模型。股动/静脉置管后，取颈前正中纵行切口，钝性分离右侧颈总动脉，结扎远心端，动脉夹夹闭近心端。在接扎线处下方插入PE50导管，导管的另一端通过三通头与Biopac多导电生理记录仪压力换能器连接，稳定数分钟后即可同时监测左室舒张末压(LVEDP)、收缩期左室内压上升最大速率（+dp/dt max）、舒张期左室内压下降最大速率(-dp/dt max)等指标。⑵每组大鼠到达相应时间点麻醉后迅速剪开胸腔，剪取心脏后立即置于4℃的生理盐水中，以便于心脏内的残余血泵出，留取左心室肌，将心尖部以10倍体积的4％多聚甲醛溶液固定，取约1mm3大小的心肌组织于2.5％戊二醛中固定，其余心肌组织剪切后分别于-80℃冰箱保存，用于Real-time PCR及WesternBlot等检测。⑶从液氮中取出冻存管，直接浸入37℃水浴中，在超净台中打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。800rpm离心5min后弃去上清液，加入5ml含10％胎牛血清培养液重悬细胞，接种于培养瓶，于5％CO2、37℃条件下培养箱静置培养。细胞长满瓶底80％后，弃去培养基，加入1ml0.25％胰蛋白酶洗一遍，吸去胰酶，再加入1ml0.25％胰酶消化细胞，润遍瓶底，倒置显微镜下观察消化细胞，加入2ml细胞培养液终止消化并用吸管吹打成细胞悬液，800rmp离心5min后弃去上清液，再加入适量培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液，将其平均接种于2-3个培养瓶中，于5％CO2、37℃条件下培养箱静置培养，2-3天更换培养液。⑷实验前一天，以每毫升3-5×104个H9c2细胞接种，以保证进行病毒感染时细胞的融合度20-30％。每孔加入稀释好的病毒及感染增强液，加入后轻摇细胞板混合均匀。混匀后继续培养，12小时以后观察细胞状态，更换新鲜完全培养基。感染3天后，观察荧光表达情况。给药干预组换成加药培养基，对照组则更换新鲜完全培养基，继续培养24小时。⑸活体大鼠左心室插管术及心功能测定;HE染色观察心肌组织病理结构;透射电镜观察心肌组织自噬小体;免疫组化检测LC3的表达;免疫荧光双染技术观察心肌细胞LC3和SERCA2的分布及共定位;MTT实验对心肌细胞活性检测;Real-timePCR检测心肌组织及心肌细胞LC3Ⅱ、Beclin1、SERCA2、PLN、及β3-AR mRNA表达;Western Blot检测心肌组织及心肌细胞LC3、Beclin1、SERCA2、PLN、及β3-AR蛋白表达。⑹利用SPSS13.0统计软件进行数据分析。所有数据采用均数±标准差表示，均数比较采用单因素方差分析和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。所有实验至少重复3次。　　结果：①脓毒性休克大鼠模型的建立及左心功能的变化。大鼠给予静脉泵入LPS后血压出现短暂的下降，之后略有上升，2h后血压可较基础值下降25-30％，动态监测MAP变化，模型组的变化与对照组相比各个时间点均有统计学意义(*P＜0.05)，进一步分析相同组别内不同时间点MAP差异发现模型组2h、4h、6h MAP值与其0h的基础值相比明显下降，均有统计学意义（*P＜0.05），说明此方法制作的脓毒性休克模型给药后2h成模，且模型稳定。对心肌组织进行HE染色后发现给药4小时与对照组相比心肌结构紊乱，偶可见炎症细胞浸润。给药6小时可见明显肌间组织断裂，大量炎性细胞浸润，提示心肌损伤严重。动态监测脓毒性休克大鼠发现休克后大鼠的心功能障碍明显，代表左心室心肌顺应性的左室舒张末压(LVEDP)则呈现明显上升的趋势，且实验组与对照组相比有统计学差异(*P＜0.05)。收缩期左室内压上升的最大速率(+dp/dt max)及舒张期左室内压下降的最大速率(-dp/dt max)明显下降，同时发现相同组内不同时间点与基础值相比下降也有统计学差异（*P＜0.05）。②脓毒性休克大鼠模型中自噬的表达。电镜下观察对照组心肌纤维排列整齐，Z线、M线、I带、A带清晰可见，相邻心肌纤维间有较多的线粒体。LPS4小时相邻心肌纤维间有大量的线粒体，但线粒体嵴多减少、空泡变或外膜破损，可见自噬溶酶体。LPS6小时组心肌纤维肌丝部分扩张。相邻心肌纤维间有较多的线粒体嵴减少或外膜破坏，可见自噬小体。免疫组化结果显示，LC3在心肌组织表达主要定位于心肌细胞的细胞质。镜下观察显示，对照组LC3染色均较少，然而实验组均可见特异性染色，且给药4小时组特异性染色明显增多，且随着干预时间的延长，染色逐渐增多。LPS模型中，与对照组相比，给药组的Beclin1表达均增多，同时随着给药时间的延长Beclin1的表达出现逐渐增多的趋势，统计分析结果发现有统计学意义（*P＜0.05）。LPS模型组的实验组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例均比对照组表达增多，且组间比较有统计学意义。mRNA的表达与蛋白水平相似，随着给药的时间延长，LC3Ⅱ和Beclin1的表达逐渐增多，给药6小时达到最多。③LPS诱导下心肌细胞自噬及收缩舒张功能的表达。免疫荧光标记的结果显示，LC3与SERCA2共同表达于细胞质，LPS诱导的心肌细胞LC3的变化趋势同大体组织的变化趋势基本一致，随着给药时间的延长LC3逐渐增多。而SERCA2的表达则与LC3的变化刚好相反，随着给药时间的延长SERCA2的表达逐渐减少。LPS诱导的H9c2细胞中LC3蛋白的表达较正常对照组明显增加，差异有统计学意义(*P＜0.05)，且随着给药时间的延长出现逐渐增多的趋势，这一趋势与大体心肌组织的表达基本相同。LPS干预后SERCA2的表达较正常对照组明显降低，差异有统计学意义（*P＜0.05）。PLN的表达则与SERCA2相反，与对照组相比表达明显增多。mRNA的表达同蛋白表达相似，随着LPS给药时间的延长，LC3Ⅱ的表达逐渐增多，SERCA2的表达逐渐下降，而PLN则呈现上升的趋势。④改变自噬活性对心肌细胞收缩舒张功能的影响。免疫荧光标记的结果显示，正常细胞组同时存在一定浓度的LC3和SERCA2的表达，LPS干预后，LC3的表达增多同时SERCA2的表达减少，而RAPA组的LC3表达较LPS组更多且SERCA2的表达减少。3-MA干预组的LC3表达较LPS组有所降低，但仍然多于正常对照组，SERCA2的表达与LPS组相比略有升高。LPS诱导的H9c2细胞中LC3Ⅱ蛋白的表达较正常对照组明显增加，而RAPA诱导下LC3Ⅱ的表达要高于LPS诱导组，差异有统计学意义（*P＜0.05）。之前的研究发现给予LPS干预后SERCA2的表达是下调的，通过RAPA的诱导SERCA2的表达出现更低的水平，而PLN的表达则刚好相反，RAPA干预后其表达比LPS组更高。实验组mRNA水平的表达基本同蛋白水平的表达相似，RAPA干预后SERCA2的表达较LPS组和正常对照组相比均减少，而PLN的表达则增高。LPS诱导的H9c2细胞中LC3Ⅱ蛋白的表达较正常对照组明显增加，而在3-MA的干预下LC3Ⅱ的表达却低于LPS诱导组，差异有统计学意义（*P＜0.05）。给予LPS后SERCA2的表达是下调的，通过3-MA的诱导SERCA2的表达反而有所增加，但与正常对照组相比未见明显差别。而PLN的变化也说明了以上问题，3-MA干预组与LPS组相比PLN的表达下降，但确未下降至正常对照组的水平。实验组mRNA水平的表达基本同蛋白水平的表达相似，3-MA干预后SERCA2的表达较LPS组略有升高，但仍比正常对照组降低，而PLN的表达则相反，3-MA组比LPS组降低。⑤转染β3-GV358上调β3-AR基因的表达对自噬活性及心肌收缩舒张功能的改变。在转染了β3-GV358之后无论加入RAPA和3-MA干预后发现β3-AR的变化较β3-GV358组相比均未见明显异常。β3-GV358组与对照组相比LC3Ⅱ的表达却明显增高，差异有统计学意义（*P＜0.05），β3-GV358+RAPA组LC3Ⅱ的水平却比β3-GV358组的表达还要高，而β3-GV358+3-MA组LC3Ⅱ的表达与β3-GV358组相比有所下降但与对照组相比仍然升高。β3-GV358组与对照组相比，SERCA2的表达减少，差异有统计学意义（*P＜0.05），β3-GV358+RAPA组SERCA2的表达比β3-GV358组还要低，差异有统计学意义（*P＜0.05），β3-GV358+3-MA组SERCA2的表达与对照组相比仍然略低，但是却高于β3-GV358组，差异有统计学意义(*P＜0.05)。PLN的表达则刚好跟SERCA2相反。⑥转染β3-shRNA沉默β3-AR基因的表达对自噬活性及心肌收缩舒张功能的改变。在转染了β3-shRNA之后无论加入RAPA和3-MA干预后发现β3-AR的变化较β3-shRNA组相比均未见明显异常。β3-shRNA组与对照组相比LC3Ⅱ的表达却明显降低，差异有统计学意义（*P＜0.05），β3-shRNA+RAPA组LC3Ⅱ的水平与β3-shRNA组相比略有升高，而β3-shRNA+3-MA组LC3Ⅱ的表达与β3-shRNA组相比有所下降。β3-shRNA组与对照组相比，SERCA2的表达明显升高，差异有统计学意义(*P＜0.05)，β3-shRNA+RAPA组和β3-shRNA+3MA组SERCA2的表达均未见明显变化，无统计学意义。PLN的表达则刚好跟SERCA2相反。　　结论：⑴通过静脉注射LPS方法成功建立脓毒性休克大鼠模型，且随着给药时间延长，心肌损伤逐渐加重，左心功能随时间延长成持续下降趋势。⑵LPS诱导大鼠脓毒症休克后的心肌细胞自噬活性明显升高，而且随着干预时间延长自噬活性逐渐增强。⑶H9c2心肌细胞在LPS干预下也表现出心肌细胞收缩舒张功能障碍，同样随时间延长呈持续下降趋势。⑷RAPA可以激活细胞自噬水平，导致心肌细胞存活率下降，心肌收缩舒张功能下降。3-MA可以抑制细胞自噬水平，导致心肌细胞存活率升高，心肌收缩舒张功能也增强。⑸脓毒症休克的心功能障碍主要以功能性、一过性改变为主，此时心肌细胞自噬主要发挥有害作用，应用了自噬抑制剂后可部分改善心肌的收缩舒张功能。⑹β3-AR的变化可以调节自噬活性的改变，但自噬无法反过来调节β3-AR的表达，β3-AR在自噬的上游对自噬活性进行调控，揭示了在脓毒性休克期β3-AR的重要性，为β3-AR亚型的研究开启了临床治疗的新思路。