凡纳滨对虾死后由于内源蛋白酶的作用,虾肉出现软化,导致虾的品质和商业价值出现下降。目前发现凡纳滨对虾头部的胰蛋白酶含量多、活性高、对肌肉的降解作用强,这些特点很可能与虾死后虾体肌肉软化存有一定关系。为探索胰蛋白酶是否为凡纳滨对虾肌肉软化现象的主要参与者,本文首先进行胰蛋白酶的提取及FITC荧光标记条件的探索,进而分析胰蛋白酶从头部向肌肉迁移情况,最后对胰蛋白酶对肌肉及肌肉蛋白的降解情况进行比较分析,为提高虾肉品质,开发新型保鲜技术奠定一定理论基础。主要研究内容和结论如下:以30-80%硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose F.F.阴离子交换柱层析以及Sephacryl S-100凝胶过滤层析等纯化方法,从凡纳滨对虾头部中提取到的胰蛋白酶,分子量为30 kDa,活力达885.07 U/mg,得率为13.77%,纯化倍数达21.77。利用FITC标记胰蛋白酶,使胰蛋白酶具有荧光性。以F/P值、F值和酶活为指标,以标记比例、时间、温度、pH值对标记效果的单因素试验结果为基础,采用L9(34)正交试验对标记条件进行了优化。最佳标记条件为FITC:酶为1:50,反应时间为24 h,温度为8℃,pH 8.0。在此条件下所得的FITC-胰蛋白酶F/P值为3.57,F值为1025.93,酶活保持了94.90%。因此,FITC可应用于标记胰蛋白酶,但FITC-胰蛋白酶的标记效果受标记比例、时间、温度和pH值等条件影响。为探索胰蛋白酶从头部向肌肉迁移情况,具体比较了凡纳滨对虾各种内源蛋白酶的活性,分析了虾中总蛋白酶酶活和胰蛋白酶酶活在贮藏期间的分布及变化,并利用FITC-胰蛋白酶的荧光性观察胰蛋白酶在肌肉及肌纤维中的迁移。酶活结果显示,虾头蛋白酶活高达90.17 U/mg,远大于虾肉蛋白酶。6种内源蛋白酶中,头部胰蛋白酶活性最高,达13.59 U/mg,是肌肉组织蛋白酶的100倍。贮藏期间胰蛋白酶从头部向肌肉扩散并迁移。贮藏4 d后检测到虾肉总酶活和胰蛋白酶活增加。于第8 d虾肉总酶活增至1.66 U/mg,胰蛋白酰胺酶和酯酶活分别达到0.97 U/mg和1.84 U/mg。荧光观察的结果表明,贮藏4 d,虾头荧光值下降42.66%,虾肉第一腹节荧光值明显上升了55.77%。贮藏8 d,虾肉第二腹节荧光值稍微上升了12.60%。另外,FITC-胰蛋白酶能透过肌纤维的肌膜和肌质。因此,虾头胰蛋白酶很可能在贮藏期间向肌肉发生迁移,并进入肌纤维中进行作用。通过比较主要内源蛋白酶对凡纳滨对虾肌原纤维蛋白的降解作用,观察胰蛋白酶对肌肉组织的溶解,证实胰蛋白酶是凡纳滨对虾肌肉蛋白的主要降解酶。虾头蛋白酶是肌原纤维蛋白降解的主要作用酶,但虾肉蛋白酶对肌原纤维蛋白几乎无降解作用。虾头蛋白酶对肌原纤维蛋白的MHC和Actin有明显降解,降解速率随贮藏温度的升高而增大。凡纳滨对虾头部中,胰蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解作用比胃蛋白酶的作用强得多。胰蛋白酶对肌原纤维蛋白的MHC降解较明显,对Actin的降解稍缓些,降解速率也随贮藏温度的升高而增大。微观结果也指出胰蛋白酶对凡纳滨对虾的肌肉组织有明显的溶解能力,能引起肌肉组织被破坏。因此,凡纳滨对虾的胰蛋白酶是肌肉蛋白的主要降解酶。