目的：　　 甲型流感病毒能导致季节性流行和爆发流行。2009年甲型H1N1流感病毒从2009年四月在世界范围内的流行。同时，高致病性禽流感H5N1在欧亚大陆60多个国家及地区流行超过十多年；尽管目前没有确切的证据证明该病毒能造成人-人传播，但是该病毒的高致死率给世界人民造成极大地恐慌。流感病毒包膜上的糖蛋白血凝素酶(hemagg1utinin,HA)与神经氨酸酶(neuraminidase,NA)是决定该病毒生命周期和免疫应答的重要成分。由于流感病毒抗原易变异，且非常容易发生重配，人群对变异株普遍易感。本研究细致阐明2009甲型H1N1及高致病性禽流感H5N1(A/Anhui/1/2005)两株流感病毒NA(神经氨酸酶)茎部氨基酸与各自的NA蛋白中的生物学特性，为流感病毒预防控制提供理论依据。　　 方法：　　 1、流感病毒膜蛋白09N1-09s60，AHN1+09s60的构建　　 经序列比对2009甲型H1N1及高致病性禽流感H5N1(A/Anhui/1/2005)的神经氨酸酶序列发现：高致病性禽流感H5N1的神经氨酸酶NA的茎部区域存在20个氨基酸的缺失，因此将2009甲型H1N1颈部区域的20个氨基酸命名为09s60。设计实验给高致病性禽流感H5N1的神经氨酸酶茎部区域插入20个氨基酸(09s60)，同时做对比给2009甲型H1N1神经氨酸酶茎部区域敲除20个氨基酸(09s60)，构建两种突变型的NA:09N1-09s60，AHN1+09s60。　　 结合假病毒系统平台，研究两种野生型与两种突变型(分别命名为09N1，AHN1，09N1-09s60，AHN1+09s60)跟各自的HA(AHH5，09H1)匹配特点。总共包裹出以下8种假病毒颗粒：09H1∷09N1,09H1∷AHN1,09H1∷09N1-09s60,09H1∷AHN1+09s60;AHH5∷09N1,AHH5∷AHN1，AHH5∷09N1-09s60，AHH5∷AHN1+09s60。观察含四种NA在流感病毒生活周期的影响，包括出芽、感染力、NA活性、与不同的HA匹配特点等。　　 2、流感假病毒颗粒(Pseudoparticle，Pps)的制作　　 假病毒系统平台主要包括两个重要元件：MLV（鼠白血病病毒）的gag-pol蛋白表达系统和基于gag-pol蛋白的报告基因EGFP系统。逆转录病毒核心蛋白gag-pol蛋白具备“出芽”功能，能将含有流感病毒的膜蛋白HANA的细胞膜顶出细胞，形成新的病毒颗粒，同时能将报告基因包裹在病毒颗粒内部，这种病毒颗粒具备病毒膜蛋白完整的生物学特性（感染力，靶向性，并能被中和抗体所中和）但是没有复制能力，被称为假病毒颗粒(Pseudoparticle，Pps)，因此是安全便捷的病毒膜蛋白研究平台。　　 将MLV-Gag-pol与Gag-psi-EGFP这两个质粒，分别与不同搭配组合的流感包膜蛋白HANA质粒共转染人293T细胞，转染后48小时后收集上清，经超速离心纯化即可获得流感假病毒颗粒(Pseudoparticle，Pps)。　　 3、流感假病毒颗粒数的定量及感染力实验　　 运用Real-timePCR对293T细胞包裹出的8种假病毒颗粒进行滴度定量，并将8种假病毒颗粒的颗粒数调整到同一水平。然后取50μLPps分别加入种好的A549细胞的96孔板中，96小时后观察A549细胞中EGFP的表达，并运用流式细胞仪对感染细胞进行定量。　　 4、流感假病毒的HA血凝实验　　 选择适当的96孔微量血凝板，所有孔中均加入50μLPBS;在第一行分别取50μL的Pps并于50μL的PBS混匀。然后从第一行的每孔中吸出50μL加至第二行的相应的每孔，混匀。依次作倍比稀释至第8行，混匀后弃去50μL。然后从第8行开始依次每孔加入50μL1％的火鸡红细胞悬液。混匀后室温静止30mins后观察并确定血凝滴度。　　 5、流感假病毒的NA活性实验　　 应用流感神经氨酸酶检测试剂盒(Na-StarInfluenzaNeuramindiaseInhibitorResistanceDetectionKit)。选择试剂盒中自带的96孔板，分别取25μL的8种Pps分别与试剂盒中的NA-starAssaybuffer1∶1混匀，混匀后加入10μL的NA-Star底物化学发光试剂，室温孵育30分钟后进行荧光测定。　　 6、运用Westernblot鉴定流感假病毒HA蛋白与NA蛋白的表达量实验　　 对裂解收毒后表达HA与NA蛋白的293T细胞和包裹出的假病毒颗粒进行westernblot实验。蛋白分别在非还原状态下进行westernblot，电泳后转膜至PVDF膜上分析。　　 结果：　　 1、运用假病毒系统平台进行试验后：对比09H1N1神经氨酸酶与AHH5N1神经氨酸酶的生物学特性，09N1的神经氨酸酶活性要大大高于AHN1的神经氨酸酶活性，09N1能释放出更多的假病毒颗粒。敲除或插入09s60这个片段，并没有改变这种关系。　　 2、在AHN1，AHN1+09s60跟AHH5匹配试验中，发现包裹出的假病毒颗粒的感染力随着NA插入09s60片段而降低。　　 3、运用westernblotting和NA抗体鉴定09NA表达情况：在分离的2009H1N1真病毒的NA蛋白表达量：二聚体＞＞四聚体＞单体；而在分离的含09N1假病毒颗粒的NA蛋白表达量：二聚体＞单体＞＞＞四聚体；对比分离的含09N1-09s60假病毒颗粒的NA蛋白表达量：单体＞＞＞二聚体。　　 4、运用westernblotting和带his抗体鉴定AHNA表达情况：在分离的AHH5N1假病毒颗粒的NA蛋白表达量：单体＞＞二聚体；对比分离的含AHN1+09s60假病毒颗粒的NA蛋白表达量：二聚体＞＞单体。在09N1与AHN1敲除或插入09s60这个片段，没有改变两者神经氨酸酶的糖基化位点。　　 5、对于NA的抑制剂达菲而言：2009H1N1的NA活性要大大高于高致病性禽流感H5N1，其NA的较高的活性也是NA抑制剂达菲体外增强2009H1N1感染力的一个关键原因。　　 结论：　　 2009H1N1的神经氨酸酶活性要大大高于AHH5N1的神经氨酸酶活性，09N1能释放出更多的假病毒颗粒，在09N1与AHN1敲除或插入09s60这个片段，并没有改变这种关系。09N1的神经氨酸酶较高的酶活性导致2009甲型H1N1对达菲的高敏感性。运用westernblotting分析HA/NA蛋白的重配情况表明：09s60这20个氨基酸是NA蛋白产生二聚体的关键所在但没有影响其NA的正常的糖基化位点。