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2010年我国开始爆发了严重的鸭坦布苏病毒病,主要感染了以水禽为主的禽类,受到影响最大的是产蛋鸭,造成产蛋鸭的产蛋量急剧下降甚至终止,部分鸭发生死亡。该病除了感染蛋鸭,也能感染其它禽类或鸟类,如鸡,鹅,麻雀等。这种病毒感染范围广,可以导致肉禽和蛋禽的感染,水禽比鸡的感染性更高,感染蛋、种禽发病率甚至达到100%,产蛋由高峰期的95%左右下降5%左右,继发感染时死亡率高达30%。鸭坦布苏病毒导致的免疫抑制也会增加继发感染的可能,对蛋鸭的养殖具有较大的威胁,在2010年为我国的养鸭业带来了巨大的损失。同时,有研究表明在养鸭场人员血清内检测到该病毒阳性,提示该病毒可能感染人类。坦布苏病毒的基因组具有典型的黄病毒基因组特点,其核酸为单股正链RNA病毒,基因全长10990bp,基因组由7个非结构基因和3个结构基因组成,编码的结构蛋白包括C、M、E蛋白,C蛋白为衣壳蛋白,M蛋白为膜蛋白,E蛋白为囊膜蛋白,有研究证实黄病毒前体膜蛋白prM可促进保护性免疫力的诱导产生,对E蛋白的结构稳定性也具有重要意义。大量对黄病毒的研究表明,囊膜蛋白E蛋白具有比较好的保守性和免疫原性,常作为亚单位疫苗或基因工程疫苗的首选基因。本研究主要包括以下内容:1、PrM和E两种多克隆抗体的制备利用大肠杆菌表达系统分别表达并纯化PrM和E蛋白,将蛋白按照方法中的程序分三次免疫白兔,分离血清得到高效价的PrM和E多克隆抗体。2、表达鸭坦布苏prM-E蛋白的重组杆状病毒AC-prM-E的构建利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将鸭坦布苏prM-E基因及其信号肽序列克隆至杆状病毒基因组,得到rBac-prM-E,将rBac-prM-E转染sf9细胞,待细胞病变后收获重组杆状病毒AC-prM-E。AC-prM-E感染sf9细胞后利用Western blot对蛋白表达进行检测,表明prM-E蛋白在sf9的细胞和上清中均成功表达。此外通过电镜可以观察到感染该重组杆状病毒AC-prM-E的sf9细胞胞内和培养基上清中有许多直径大小约为30-50nm的空泡状颗粒存在,表明大部分prM-E蛋白在sf9细胞中自组装成类病毒颗粒,该颗粒为坦布苏病毒样颗粒。3、prM-E病毒样颗粒的纯化和亚单位疫苗的制备和免疫试验将感染了 AC-prM-E的sf9细胞培养上清和细胞内的prM-E病毒样颗粒分别通过蔗糖梯度离心进行纯化后,与佐剂混合制备成亚单位疫苗,免疫樱桃谷鸭,结果表明该疫苗可以诱导机体产生针对E抗原的特异性抗体。4、利用表达prM-E蛋白的sf9细胞裂解上清制备亚单位疫苗及免疫攻毒试验将感染了 AC-prM-E的sf9细胞裂解后,离心收集上清,与佐剂混合制备成亚单位疫苗免疫产蛋麻鸭,并在免疫后28天利用鸭坦布苏DF2株攻毒,结果对照组卵巢发生破裂,萎缩。免疫一组和免疫二组中分别有2或3只蛋鸭卵巢未发生明显病变,统计本次实验中该疫苗攻毒保护率为40%或60%。5、表达鸭坦布苏E基因EⅢ结构域的重组杆状病毒AC-2EⅢ的构建和初步验证构建了表达鸭坦布苏病毒主要抗原区域EⅢ的重组杆状病毒AC-2EⅢ,结果表明EⅢ蛋白在sf9细胞内和培养基上清中呈可溶性表达。