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本论文以云南境内分布的灯盏花(Erigeronbreviscapus)居群为研究对象,分别从形态水平、分子水平研究灯盏花居群遗传变异式样,探讨灯盏花居群遗传结构;同时,选取灯盏花14个居群、北美灯盏花(E.bellidiastrum)、须弥紫菀(Asterhimalaicus)和察瓦龙紫菀(A.tsarungensis)进行ITS序列分析。综合探讨灯盏花居群遗传背景,并试图从花序形态结构和DALP分子标记以及ITS序列,区分鉴定灯盏花药材收购中混入的紫菀植物,为云南灯盏花药用植物资源的开发和利用提供科学依据和基础资料。研究结果概括如下:
1对4个灯盏花居群以及1个须弥紫菀居群的22个形态性状进行了研究。各性状变异系数的取值范围在0%-85%之间,花部各性状的变异系数集中分布于8%-28%之间。主成分分析和聚类分析表明:灯盏花与须弥紫菀之间形态差异明显。依据花部形态性状可以对灯盏花和须弥紫菀进行区别。须弥紫菀的总苞片宽(外,中,内),舌状花舌片长,舌状花舌片宽,管状花长,管状花裂片长均大于灯盏花。但是,在舌状花层数和舌状花个数上,灯盏花多于须弥紫菀。
巢式方差分析显示:灯盏花平均有18.8%的变异来自于居群间,81.2%的变异来自于个体间。
2采用DALP(Directamplificationoflengthpolymorphism)分子标记技术,对13个灯盏花居群和2个须弥紫菀居群及1个察瓦龙紫菀居群进行DNA指纹检测。筛选出5个引物组合,共检测到122个基因位点,平均每对引物产生24.4条带。除P235R2无特征带外,其余4个引物组合共产生13条鉴别特征带。其中,灯盏花的5条特征带集中在800bp和400bp之间,须弥紫菀7条特征带,察瓦龙紫菀一条特征带,集中在3000和1000bp处。这些特征带可以把灯盏花和须弥紫菀和察瓦龙紫菀区别开来。灯盏花13个居群扩增得到118个多态位点,13个居群总的多态性片段PPB为96.72%,居群平均PPB为28.12%;13个居群总的Shannon多样性指数I为0.3396,居群平均I为0.1408;13个居群总的Neis基因多样性指数H为0.2095,居群平均H为0.0935;13个居群总的平均观察等位基因数Na为1.9672,居群平均Na为1.2812,13个居群总的平均有效等位基因数Ne为1.3226,居群平均Ne为1.1607。灯盏花基因分化系数Gst为0.5488,即大约有45.12%的遗传变异来自居群内,54.88%的遗传变异来自居群间。表明灯盏花居群间遗传分化剧烈,种内分化突出。
根据遗传距离的UPGMA聚类图可以将滇中地区灯盏花药材中混入的须弥紫菀区分开来,并将滇西北地区灯盏花药材中混入的须弥紫菀和察瓦龙紫菀区分开。
3用PCR产物直接测序法,测定其核糖体内转录间隔区序列并作同源性分析。对灯盏花14个居群和药材收购中经常混入的须弥紫菀及察瓦龙紫菀的核糖体内转录间隔区(ITS)基因序列进行分析,提供区分的分子鉴定依据;并对来自美洲的近缘种北美灯盏花的ITS序列(AF477644)进行了遗传相似性分析。根据rRNAITS区碱基序列分析结果,14个不同地理种源的灯盏花居群ITS序列变异程度非常低,稳定保守。通过ITS测序分析,可以将药材收购中经常混入的须弥紫菀和察瓦龙紫菀的与灯盏花区分鉴定开来。