背景自Folkman等首次证实促血管生长因子的存在以来,微血管重组即成为缺血性疾病治疗策略的一部分(例如,治疗性血管新生)。并逐步认识到通过修复微循环来增强心血管功能的治疗策略导致了急、慢性缺血性疾病的治疗模式的转变。首先是通过一系列在心肌以及肢体远端缺血模型中有关VEGF和bFGF等重组生长因子的临床前研究来评估该新微血管治疗策略。然而,如何使重组促血管生长因子在靶治疗部位保持适当水平则是该治疗的瓶颈且费用昂贵。因此,之后相继进行的试验评价了治疗性血管新生的潜在运用价值。自上世纪90年代末人类开展首例有关外周和冠状动脉疾病的血管新生基因治疗试验以来已有15年了。此后进行的大量实验或相关临床前研究证实了血管新生基因的生物活性、揭示血管新生的机制,且一些早期的临床试验也已证实促血管新生基因治疗的安全性、可行性以及有效性。尽管对治疗性血管新生研究有很高的期望,然而有关VEGF等促血管新生因子治疗缺血性心血管疾病以及外周动脉疾病的Ⅱ期和Ⅲ期临床试验结果显示患者未能从相关促血管新生治疗中获益,揭示了依靠单一生长因子很难完成血管新生。因此,需要进一步拓展促血管新生的替代战略。血管新生是一个精细的和时序性的复杂过程需要许多基因、调节子以及通路的参与。HIF-1作为一个重要的核转录因子,能直接或间接的调节100多种促血管新生基因,被认为具有“总开关”的特点,是血管新生的中心环节。HIF-1是由α和p两个亚基组成的异二聚体,α亚基为其功能活性亚基,其与β亚基结合后,从胞浆转位到核内对下游靶基因转录调控。其包含一段氧依赖降解区域(oxygen dependent degradation domain, ODDD),参与氧调节的HIF-1α稳定性调节。HIF-1α的C末端包含两个与HIF-1α转录活性调节有关的转录激活域(transactivation domain, TAD),即N-TAD和C-TAD。然而,HIF-1α在常氧条件下极不稳定且转录活性很低,很难发挥其促血管新生效应,HIF-1α稳定性和转录活性高度受氧浓度调节。常氧条件下,HIF-1αODDD区内第402位或／和第564位上的脯氨酸残基(Pro402和／或Pro564)被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domain, PHD)羟化后,HIF-1α经泛素途径降解,故HIF-1α在常氧条件下的半衰期很短,约1-2min,5min即可全部降解。同时,HIF-1αC-TAD区内第803位点上的天门冬酰胺(Asn803)被天冬酰胺酰羟化酶(factor inhibiting HIF-1, FIH-1)羟化,致使其转录活性下降。故即使蛋白稳定的HIF转位到核内后,也因HIF-1α的C-TAD Asn803羟化,激活下游靶基因的能力下降；低氧时,PHD和FIH-1的活性到抑制,故HIF-1α不被降解因而变得稳定且具有高效的转录活性。因此,根据其稳定性和转录活性的氧依赖的调节机制,我们利用基因突变技术将其基因序列上与稳定性调节有关的第402和564位点上的脯氨酸残基和／或与转录活性调节有关的第803位点上的天冬氨酰残基突变为丙氨酸残基,以期突变HIF-1α在常氧条件下更稳定和／或具有高效的转录活性,从而能在常氧条件下有强大的促进血管新生潜能。HIF-1α作为一个核转录因子能调控如此众多的下游靶基因取决于其与转录辅助激活因子(coactivator)的共同作用。研究证实HIF-1αC-TAD可与辅助激活因子CREB结合蛋白／腺病毒E1A相关蛋白p300 (CREB-binding protein/adenovirus E1 A-binding protein p300, CBP/p300)相互作用从而激活下游基因的转录。同时,组蛋白去乙酰酶(histone deacetylase, HDAC)通常与转录抑制有关,意味着HDAC具有辅助激活因子的功能,相关实验也证明了HDAC能增强HIF-1α的转录活性。进一步研究发现,CBP/p300结构域培殖了CH1缺陷型大鼠,阻断了HIF-1α与CBP/p300转录激活区内的CH1结构域之间的相互作用,发现有35%-50%HIF-1α下游靶基因的表达需要CBP/p300的CH1结构域,因而提出HIF-1α存在CH1依赖性机制,曲古抑菌素A (trichostatin A,TSA)为HDAC阻滞剂,用TSA处理可抑制70%HIF-1α下游靶基因的表达。CH1基因敲除和TSA联合处理可抑制90%以上的HIF-1α下游靶基因的表达。然而,HIF-1α诱导的促血管新生基因与CBP/p300或/和HDAC存在什么样的定量调节关系?以及它们是如何发挥作用的?这些问题尚不清楚。目的本研究旨在比较野生型以及各突变型HIF-1α基因在常氧条件下的稳定性及转录活性、对其诱导的血管新生基因稳定性的影响和体外血管新生潜能,以期筛选出最优的突变型HIF-1α基因,为在体血管新生研究奠定理论基础；同时初步探讨CBP/p300或/和HDAC与HIF-1α诱导的促血管新生基因之间的定量调节关系。方法1)将购自Clonetics公司的人肺微血管内皮细胞按说明书所述方法进行培养,运用透射电镜对人肺微血管内皮细胞进行形态学观察,并采用免疫荧光染色法对人肺微血管内皮细胞特异表达的vWF和CD31分子进行鉴定。2)携三突变型HIF-1α基因重组腺病毒载体体外扩增、纯化将本课题组所构建的携三突变型HIF-1α基因重组腺病毒载体Ad-HIF-1α-Trip在HEK293细胞内大量扩增并经氯化铯梯度离心法进行纯化,并以扫描电镜对纯化后病毒进行形态学鉴定、以终点稀释实验法测定纯化后重组腺病毒滴度以及经X-gal染色确定转染效率。进一步采用PCR方法对纯化后病毒所携三突变型HIF-1α基因序列进行完整性鉴定。[注：本研究中涉及的重组腺病毒载体有：携野生型HIF-1α基因重组腺病毒载体(Ad-HIF-1α-native)、携Pro564单突变型HIF-1α基因重组腺病毒载体(Ad-HIF-1α-564)、携Pro402Pro564双突变型HIF-1α基因重组腺病毒载体(Ad-HIF-1α-564/402)、携Pro564Asn803双突变型HIF-1α基因重组腺病毒载体(Ad-HIF-1α-564/803)、携Pro402Pro564 Asn803三突变型HIF-1α基因重组腺病毒载体(Ad-HIF-1α-Trip)以及对照腺病毒空载体(Ad-Null)]。3)野生型以及各突变型HIF-1α基因HIF-1α本身及其诱导的促血管新生基因的表达：(1)mRNA水平：HMVEC-Ls以8.0×103 cells/孔密度接种于96孔板,置于2%FBS EBM培养基中继续培养,分别用Ad-HIF-1α-native、Ad-HIF-1α-564、Ad-HIF-1α-564/402、Ad-HIF-1α-564/803、Ad-HIF-1α-Trip以及Ad-Null以MOI=200转染HMVEC-Ls,并于72 h后收获细胞并采用QuantiGene 2.0 Plex检测HIF-1α、VEGF1αPLGF、PAI-1、PDGF、Ang-1、Ang-2以及LEP等基因的表达；(2)蛋白水平：HMVEC-Ls以5.0×103cells/cm2密度接种于150cm2培养瓶,置于2%FBS EBM培养基中继续培养,分别用Ad-HIF-1α-native、Ad-HIF-1α-564、Ad-HIF-1α-564/402、Ad-HIF-1α-564/803、Ad-HIF-1α-Trip以及Ad-Null以MOI=200转染HMVEC-Ls,并于72 h后分别收获细胞和培养上清,分别采用Western Bolt或ELISA法检测HIF-1α、VEGF、PLGF、PDGF以及Ang-2蛋白表达水平。4)野生型以及各突变型HIF-1α基因HIF-1α本身及其诱导的促血管新生基因mRNA的半衰期：HMVEC-Ls以8.0×103cells/孔密度接种于96孔板,置于2% FBS EBM培养基中继续培养,分别用Ad-HIF-1α-native、Ad-HIF-1α-564、Ad-HIF-1α-564/402、Ad-HIF-la-564/803、Ad-HIF-1α-Trip以及Ad-Null以MOI=200转染HMVEC-Ls,并于48 h后使用10umol/L放线菌素D干扰RNA合成,分别与干扰后立即、1、2、4以及6h收获细胞并采用QuantiGene 2.0 Plex检测HIF-1α、VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF等基因的表达水平变化；5)野生型以及各突变型HIF-1α基因体外血管新生研究：(1)采用MTS法测定野生型以及各突变型HIF-1α基因对人肺微血管内皮细胞增殖的影响：HMVEC-Ls以8.0×103cells/孔密度接种于96孔板,置于2%FBS EBM培养基中继续培养,分别用Ad-HIF-1α-native、Ad-HIF-1α-564、Ad-HIF-1α-564/402、Ad-HIF-1α-564/803、Ad-HIF-1α-Trip以及Ad-Null以MOI=200转染HMVEC-Ls,分别在转染后的第1、3、5和7天采用MTS试剂盒于490nm检测细胞增殖率。(2)采用划痕实验测定野生型以及各突变型HIF-1α基因对人肺微血管内皮细胞迁移的影响：HMVEC-Ls以1.0×104cells/孔密度接种于35 mm培养皿,置于4%FBS EBM培养基中继续培养72 h以形成完全融合的单细胞层,然后用200uL无菌枪头在单细胞层上每间隔3mm划痕,PBS轻轻洗去细胞碎片,分别用Ad-HIF-1α-native、Ad-HIF-1α-564、Ad-HIF-1α-564/402、Ad-HIF-1α-564/803、Ad-HIF-1α-Trip以及Ad-Null以MOI=200转染HMVEC-Ls,于8-12 h后拍照,并用图像分析软件IPP6.1分析HMVEC-L在各突变型HIF-1α基因作用下的迁移能力。(3)采用成管实验检测野生型以及各突变型HIF-1α基因对人肺微血管内皮细胞管样形成的影响：HMVEC-Ls以1.0×104cells/孔密度接种于Growth factor-reduced Matrigel预先包被的96孔板,置于2%FBS EBM培养基中继续培养,分别用Ad-HIF-1α-native、Ad-HIF-1α-564、Ad-HIF-1α-564/402、Ad-HIF-1α-564/803、Ad-HIF-1α-Trip以及Ad-Null以MOI=200转染HMVEC-Ls,于8-12 h后拍照,并用图像软件IPP6.1分析HMVEC-L在各突变型HIF-1α基因作用下的管样形成能力。(4)采用渗漏性实验检测野生型以及各突变型HIF-1α基因体外所诱导新生血管的成熟度：HMVEC-Ls以1.0×104cells/孔密度接种于12孔Transwell,置于2%FBS EBM培养基中,分别用Ad-HIF-1α-native、Ad-HIF-1α-564、Ad-HIF-1α-564/402、Ad-HIF-1α-564/803、Ad-HIF-1α-Trip以及Ad-Null以MOI=200转染HMVEC-Ls后继续培养,待形成单细胞层后同时向上层小室加入1 U/mL凝血酶和1mg/mL分子量为100,000的FITC-dextran,分别于加入凝血酶后的0、4、8、12、24、48、72和96 h在下层小室中取25μL培养基,并立即检测其荧光值。6) CBP/p300或／和HDAC在HIF-1α诱导的促血管新生基因转录中的作用研究：HMVEC-Ls以8.0×103cells/孔密度接种于96孔板,置于2%FBS EBM培养基中继续培养,接受40μmol/L姜黄素或／和100ng/mL TSA预处理1h后,分别用Ad-HIF-1α-native、Ad-HIF-1α-564、Ad-HIF-1α-564/402、Ad-HIF-1α-564/803、Ad-HIF-1α-Trip以及Ad-Null以MOI=200转染HMVEC-Ls并继续培养,24 h后收获细胞并采用QuantiGene 2.0 Plex检测HIF-1α、VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF等基因的表达水平变化；结果1) HMVEC-Ls形态多样,但是融合后呈典型的“鹅卵石”样外观,免疫荧光染色呈vWF和CD31双阳性。透射电镜见到HMVEC-Ls内有内皮细胞特有的细胞器——Weibel-Palade小体。2)在HEK293细胞内扩增并纯化后的重组腺病毒Ad-HIF-1α-Trip的滴度分别为1.99×1012pfu/ml。纯化后病毒PCR检测腺病毒骨架及所携HIF-1α基因均得到预期的287bp、380bp、460bp和214bp扩增产物,三突变型HIF-1α基因序列与GeneBank中HIF-1α基因序列比对后发现编码第402、564以及803位点上氨基酸的密码子分别由CCA→GCA、CCC→GCC以及AAT→GCT。电镜结果显示腺病毒形态学特点,无支原体、衣原体污染；转染HEK293后X-gal染色显示,最佳转染复数为200pfu/cell。3)虽然三突变型HIF-1α基因在常氧条件下的mRNA表达水平与Pro402Pro564双突变型HIF-1α基因相比无显著差异(P=0.104),但是高于野生型以及其它突变型HIF-1α基因(all P<0.01)。而三突变型HIF-1α基因在常氧条件下的蛋白表达水平高于包括Pro402Pro564双突变型HIF-1α基因在内其它所有突变型以及野生型HIF-1α基因(all P<0.001)。同时,与野生型以及其它突变型HIF-1α基因诱导的下游血管新生基因的表达水平相比,无论在mRNA水平还是蛋白水平,三突变型HIF-1α基因高效促进下游血管新生基因的表达(all P<0.01)。4)无论是否含有803位点突变,虽然含有Pro564单个位点突变的HIF-1α基因(Ad-HIF-1α-564和Ad-HIF-1α-564/803)之间以及含有Pro402Pro564两个位点突变的HIF-1α基因(Ad-HIF-1α-564/402和Ad-HIF-1α-Trip)之间的mRNA半衰期无显著性差异(P=0.082和0.199),但是含有Pro402Pro564两个位点突变的HIF-la基因mRNA半衰期显著长于含有Pro564单个位点突变的HIF-1α基因(allP<0.01)。同时,与野生型以及其它突变型HIF-1α基因诱导的促血管新生基因的mRNA半衰期相比,三突变型HIF-1α基因显著的延长其诱导的簇血管新生基因的mRNA半衰期(all P<0.01)。5)与野生型以及其它突变型HIF-1α基因体外促血管新生能力相比,三突变型HIF-1α基因显著的促进HMVEC-L增殖(all P<0.001)、迁移(all P<0.001)以及管样形成(all P<0.05),且显著减少新生血管的渗漏率(all P<0.001)。6)分别使用姜黄素和TSA抑制CBP/p300和HDAC的功能,能显著的减少野生型及其它突变型HIF-1α基因本身HIF-1α以及其诱导的血管新生基因的表达(all P<0.001),且具有相同的趋势；与分别抑制时的各基因表达水平相比,同时抑制CBP/p300和HDAC的功能后,野生型及其它突变型HIF-1α基因以及其诱导的血管新生基因的表达进一步减少(all P<0.001)。在CBP/p300或/和HDAC的功能被抑制的过程中的表达相比,三突变型HIF-la基因诱导的下游血管新生基因mRNA水平仍显著高于与野生型及其它突变型HIF-1α基因(all P<0.01)。结论1)三突变型HIF-1α基因在常氧条件下更稳定且具有高效的转录活性,增加下游血管新生基因mRNA的稳定性以及在体外诱导更为成熟的新生血管。因此,具有强大的促血管新生潜能。2)在HIF-1α诱导的血管新生基因转录过程中,CBP/p300依赖的调节机制与HDAC依赖的调节机制并非相对独立的,它们之间具有协同效应。