背景与目的:　　 淋巴瘤是起源于淋巴结和淋巴组织的免疫系统恶性肿瘤，是最早发现的血液系统恶性肿瘤之一。我国淋巴瘤死亡率为1.5/10万，其中非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkin lymphoma，NHL)占90％左右。NHL病死率高，化疗副作用大。因此新型的低副作用的抗肿瘤药日渐受到人们关注。　　 热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是1962年发现的一种高度保守的胞浆蛋白质家族。随后人们又发现HSPs可以作为分子伴侣(molecular chaperone)稳定其他细胞内蛋白质的结构和功能，从而发挥有效的保护细胞的作用，这些被保护的蛋白称为客户蛋白(client proteins)。哺乳动物体内的HSPs可根据其分子量大小分为5个家族：Hsp100，Hsp90，Hsp70，Hsp60及小分子HSPs。热休克蛋白作为分子伴侣的多种活性能保护肿瘤细胞中的各种蛋白，特别是参与调节细胞周期的蛋白，激酶蛋白，以及其他影响肿瘤细胞生长的蛋白。　　 随着对恶性肿瘤的发生，进展及转移过程中的分子，遗传及生化改变的了解，人们逐渐将药物研究的重点从经验性治疗转移到针对恶性肿瘤表型的分子靶向治疗。恶性肿瘤具有遗传性不稳定的特点，也称为遗传多态性，这种特性让肿瘤细胞很容易逃逸单一的分子靶向治疗。细胞的生长发育过程中的信号传导系统是一个复杂的，相互联系的网络系统，因此，仅仅针对一两个蛋白分子的治疗并不能改变多数肿瘤细胞的活性。如果能够干涉某个能影响多个信号通路的蛋白质靶点，则可能极大的提高肿瘤的治疗效能。Hsp90和Hsp70有多种客户蛋白，对热休克蛋白抑制则是一种针对多个靶点的分子靶向治疗，这能影响肿瘤细胞增生的信号通路中的多个蛋白，也是近年来研究的热点。　　 姜黄素(curcumin，Cur)是中药姜黄中提取的酚性色素，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等广泛的药理作用。已有实验研究表明姜黄素能明显诱导非霍奇金淋巴瘤细胞系Raji细胞凋亡。我们早期的实验研究表明姜黄素诱导凋亡的机制可能是作为去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACI)抑制Raii细胞中Ⅱ类去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)HDAC6的表达，从而促进Hsp90的乙酰化，影响Hsp90的分子伴侣功能，并且通过影响Hsp90下游的多种客户蛋白实现抗肿瘤作用，这可能是姜黄素对肿瘤细胞有多个作用靶点的原因。近来的研究发现，多种HDACI及HSP90抑制剂(如LAQ824，17AAG，17-DMAG，IPI504等)在抑制Hsp90功能的同时，都能观察到Hsp70蛋白的表达增加。而姜黄素作为新一代的HDACI，是否也能导致肿瘤细胞中Hsp70表达量的增加尚未见报道。　　 白藜芦醇(resveratrol，Res)是从多种葡萄属植物中提取的多酚类化合物，具有抗炎，抗菌，抗肿瘤等作用。白藜芦醇能通过多种途径抑制肿瘤细胞的发生和发展。Prabir K等最近发现白藜芦醇能诱导K562细胞凋亡，其主要机制是通过抑制HSF1的转录活性下调Hsp70的表达。我们前期的实验研究也表明白藜芦醇能从基因和蛋白水平降低Raji细胞中Hsp70的表达，并能诱导Raji细胞凋亡。　　 当细胞内Hsp90的功能受到抑制时，Hsp70能“替补”Hsp90的功能，继续发挥保护客户蛋白的作用，维持细胞稳定，使肿瘤细胞免于凋亡。姜黄素如存在诱导Hsp70表达的作用，就可能会影响其最终的抗肿瘤效能，为此我们观察了姜黄素在抑制Raji细胞的Hsp90伴侣功能的同时，是否导致了Hsp70表达的增加，如果的确存在类似现象，再将前期试验中证实的对Hsp70有抑制作用的白藜芦醇与姜黄素联合用药，观察联合用药与各自单独用药在Raji细胞中对Hsp70表达量的影响及最后的促凋亡效果，初步探讨其潜在的机制，为中药的联合应用提高抗肿瘤效能提供新思路。　　 实验材料与方法：　　 1.细胞来源及培养　　 人非霍奇金淋巴瘤细胞系Raji细胞购自上海生命科学院细胞库。体外培养Raji细胞，取对数生长期细胞做实验。　　 2.实验方法　　 ①不同浓度的白藜芦醇和姜黄素与Raji细胞共培养，光学显微镜观察细胞形态变化。　　 ②Western-blot及RT-PCR法检测不同药物浓度和处理时间前后Raji细胞中Hsp70或Hsp90的蛋白和mRNA表达水平。　　 ③CCK8法检测用药前后Raji细胞的增生抑制情况。　　 ④流式细胞仪检测用药前后Raji细胞的凋亡情况。　　 3.统计分析　　 计量资料的描述用均数±标准差(x±s)。多组的计量资料比较采用方差分析，组间比较采用LSD-t检验；两组间比较采用成组设计的t检验。所有数据均应用SPSS13.0统计软件处理，检验水准定为P≤0.05差异有统计学意义。　　 结果：　　 1.姜黄素对Raji细胞中Hsp70蛋白表达的影响。与对照组相比，姜黄素25μmol/L处理Raji细胞12h、24h、36h后Hsp70的表达有所增加，但差异无统计学意义(P=0.411)，两两比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。与对照组相比，姜黄素50μmol/L处理Raji细胞12h、24h、36h后Hsp70的表达逐渐增加，统计分析示差异有统计学意义(P=0.014)，两两比较显示，姜黄素50μmol/L处理后36h与0h、12h、24h相比差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 2.姜黄素对Raji细胞中Hsp70 mRNA表达的影响。与对照组相比，姜黄素50μmol/L处理Raji细胞12h、24h、36h后Rjii细胞中Hsp70的mRNA表达水平明显上升。统计分析示差异有统计学意义(P=0.001)，两两比较示白藜芦醇处理后24h、36h与对照组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 3.白藜芦醇对Raji细胞中Hsp90蛋白表达的影响。与对照组相比，白藜芦醇100μmol/L处理Raji细胞24h，48h，72h后Raji细胞中Hsp90的表达水平逐渐下降。统计分析示差异有统计学意义(P=0.001)，两两比较示白藜芦醇处理后48h、72h与对照组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 4.白藜芦醇对Raji细胞中Hsp90mRNA表达的影响。与对照组相比，白藜芦醇100μmol/L处理Raji细胞24h、48h、72h后Raji细胞中Hsp90的mRNA表达水平逐渐下降。统计分析示差异有统计学意义(P=0.000)，两两比较示白藜芦醇处理后0h与24h、48h、72h之间差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 5.比较白藜芦醇100μmol/L与姜黄素50μmol/L联合用药及各自单独用药后48hRaii细胞中Hsp70的蛋白表达情况，姜黄素单独用药组比联合用药组、对照组、白藜芦醇单独用药组Hsp70表达水平高，统计分析示差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 6.姜黄素与白藜芦醇联合用药及各自单独用药48h后Raji细胞的增生抑制情况。姜黄素与白藜芦醇单独用药均能有效抑制Raji细胞的增生，以姜黄素更为明显，联合用药后抑制作用最强，差异有统计学意义(P＜0.05)，两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。姜黄素与白藜芦醇两药的相互作用指数γ＜1。　　 7.姜黄素与白藜芦醇不同的顺序用药对Raji细胞中Hsp70蛋白表达的影响。实验分四组：分别为空白对照组(Control)即无药物细胞培养48小时；姜黄素50μmol/L用药24h后洗脱，白藜芦醇100μmol/L继续用药24h(Cur→Res)；白藜芦醇100μmol/L用药24h后洗脱，姜黄素50μmol/L继续用药24h(Res→Cur)；将已处对数生长24小时的细胞加入白藜芦醇100μmol/L和姜黄素50μmol/L同时处理24h(Res+Cur)。结果示Cur→Res组Hsp70表达量比其余各组高，差异有统计学意义(P＜0.05)，其余各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 8.流式细胞仪检测细胞凋亡。分组同上一步实验。三组处理组均能诱导Raji细胞凋亡，以Res→Cur组最为明显，Res+Cur组次之。统计分析示差异有统计学意义(P=0.012)。结论　　 1.姜黄素能诱导Raji细胞中Hsp70蛋白和mRNA的表达。　　 2.白藜芦醇不仅能抑制Raji细胞中Hsp70蛋白和mRNA表达，还能抑制Raji细胞中Hsp90蛋白和mRNA的表达。　　 3.白藜芦醇与姜黄素联合用药比姜黄素单独用药后Raji细胞中Hsp70的表达量低，白藜芦醇能拮抗姜黄素诱导产生Hsp70。　　 4.白藜芦醇与姜黄素联合用药比各自单独用药更能抑制Raji细胞增生，两药之间相互作用为协同作用。　　 5.白藜芦醇不能抑制姜黄素已经诱导产生的Hsp70，而当白藜芦醇用在姜黄素之前或与姜黄素同时用药时，能拮抗姜黄素对Hsp70的诱导。　　 6.不同的用药顺序对Raji细胞诱导凋亡的作用不同，先用白藜芦醇再用姜黄素比相反的用药顺序及两者同时用药更能诱导细胞凋亡，两者同时用药比先用姜黄素再用白藜芦醇诱导Raji细胞凋亡更明显。