论文部分内容阅读
Wnt蛋白是一类重要的形态发生素(morphogen)和分泌型信号分子，Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)在物种进化中高度保守，在生物体发育、组织稳态调节、干细胞维持甚至癌症发生过程中都起着重要作用。因此，Wnt信号通路转导调控的分子机制受到了广泛而深入的研究。 Wnt信号的产生来源于Wnt分泌细胞产生并分泌Wnt蛋白，Wnt蛋白的分泌需要经过酰基转移酶Porcu pine进行脂修饰并由特定的适配器Wntless携带运输，而目前基于细胞囊泡运输水平的Wnt蛋白转运机制尚待查清;retromer-SNX3可介导Wntless回收的过程虽已被阐明，而回收后的Wntless如何持续循环以维持Wnt蛋白分泌的分子机制尚不清晰。 本项研究工作利用黑腹果蝇(Drosophila Melanogaster)进行遗传筛选，在果蝇体内诱导RNAi表达以敲除基因，从而筛查出调节Wingless/Wnt蛋白分泌的基因以及调控Wingless/Wnt信号转导的基因，并进行详细而深入的分子机制探讨。 在筛选中发现缺失Dsys1可导致Wingless/Wnt蛋白分泌缺陷的表型，在果蝇翅膀成虫盘中敲除Dsys1直接导致Wntless蛋白的转运受阻，并通过遗传上位实验证实Dsys1在retromer-SNX3下游调控Wntless蛋白转运，还发现敲除Dsys1下游的栓系效应器也可以导致相似表型。研究结果表明，Dsys1介导反向运输的Wntless重新定位到高尔基体，以维持Wingless/Wnt蛋白分泌的过程。 还筛选到p24蛋白家族成员Baiser、CHOp24以及Eclair调控Wingless/Wnt蛋白由内质网向高尔基体的正向转运过程，通过果蝇遗传补救实验证实Baiser不可替代CHOp24或Eclair的功能，还利用双分子荧光互补等实验证实这些p24蛋白家族成员间可以互相形成复合体，作为特异性的适配器(cargoselector)选择性结合Wingless/Wnt蛋白，从而协助其由内质网向高尔基体正向转运，并且p24蛋白家族中各成员角色不同，不可互相替代，具备功能多样性而非功能性冗余。 在本项研究工作中，还在果蝇体内验证了高度保守的Tankyrase对Wingless/Wnt信号转导的调控作用，分别在体内和体外证实Tankyrase可以对Wingless/Wnt信号转导通路的重要组成成分Axin进行调节，通过调控Axin降解而间接影响Wingless/Wnt信号转导。通过免疫共沉淀实验证实Tankyrase可以与Axin的特定区域相结合，以催化修饰并最终导致其降解，还在果蝇体内观察到缺失Tankyrase直接导致Axin显著积累，然而在果蝇翅膀成虫盘中敲除Tankyrase并未影响翅膀发育，证实Tankyrase对Wingless/Wnt信号转导的调控具有局限性，并观察到Tankyrase仅在Axin高浓度时对Wnt信号转导的调控作用比较显著。