论文部分内容阅读
胞外聚合物(EPS)是微藻细胞在代谢过程中产生的高分子物质，其中多种官能团通过络合、转化等反应改变周围环境的元素形态和活性，在医药、污染生物修复中具有广泛应用前景。目前，国际上有关微藻胞外聚合物的提取方法没有统一标准，且关于不同环境因素对微藻EPS的影响也没有进行系统的研究。胞外聚合物在微藻对砷的富集和形态转化过程中的作用还未见报道。因此，本文选取模式微藻--莱茵衣藻为材料，首先对其胞外聚合物的提取方法进行了优化，并结合红外光谱(FTIR)和荧光染色.激光共聚焦显微镜对其进行表征;然后研究了不同外界环境因素(生长阶段、磷酸盐、培养基、pH、铜)对莱茵衣藻的生长、EPS产量及各组分变化的影响规律;最后探索了砷酸盐As(Ⅴ)和亚砷酸盐As(Ⅲ)对莱茵衣藻生长和EPS的影响规律，并比较有无EPS的莱茵衣藻对As(Ⅴ)的富集和形态转化的影响。研究结果如下:
1.莱茵衣藻EPS的提取与表征
采用加热法、NaOH法、EDTA法、阳离子交换树脂(CER)法、高速离心法提取莱茵衣藻的EPS，比较分析每种方法得到的EPS的含量及其组成成分，并结合LIVE/DEAD BacLight染色和激光共聚焦显微镜观察细胞活性，以确定莱茵衣藻EPS最适宜的提取方法。
结果表明，不同提取方法得到的EPS各组分含量有显著差异，5种方法的提取总量从多到少依次为:NaoH法＞加热法＞CER法＞EDTA法＞离心法。当NaOH浓度为1mol.L-1时，EPS的提取量达到111.87±0.91mg·g-1，但NaOH提取导致细胞破裂，DNA含量显著增加;当加热温度为50℃时，EPS提取量为40.06±0.30mg·g-1，荧光染色和激光共聚焦显微镜检测结果表明，加热法对微藻细胞的破坏程度较小，并且提取效率较高、操作简单，因此确定加热法为莱茵衣藻EPS的最适宜提取方法。
傅里叶红外光谱分析结果表明，加热法提取的EPS出现N-H、C=O或C-N(蛋白质)和C-H、C-O-C、RHC(OH)(OR)(糖类)等吸收峰，为后续研究微藻EPS与重金属之间的相互作用提供了理论依据。
2.不同环境因素对莱茵衣藻EPS的影响
采用实验室培养，研究不同生长阶段、磷酸盐浓度、TAP培养基浓度、溶液pH、铜浓度对莱茵衣藻的生长情况、EPS以及各组分含量的影响规律。
结果表明，在微藻的不同生长阶段，其生长情况和微藻所分泌的EPS的总量及各组分含量有显著差异，当微藻生长至稳定期时(96h)，EPS含量相对较高(40.9mg·g-1)，DNA占EPS百分最低(0.93％)，因此，在96h进行EPS的提取效果最佳。不同营养盐对莱茵衣藻的影响十分显著。处于低磷条件下的莱茵衣藻会通过分泌大量蛋白质来抵御该胁迫，相反在磷浓度较高时，微藻则会产生更多的多糖类物质;而当TAP培养基浓度过高或过低时，均会抑制莱茵衣藻的生长。提高培养基的浓度，藻细胞会通过增加蛋白同时降低多糖的产量来抵御该胁迫。相反，当降低培养基的浓度，会显著降低EPS的分泌量。改变溶液酸度(pH值)会影响微藻的生长，随着溶液pH的升高，微藻会通过提高蛋白并降低多糖的含量应对该环境胁迫。随着铜浓度的增加微藻的生长也受到显著抑制，并且会刺激藻细胞产生更多的多糖。综上所述，面对外界环境的改变，莱茵衣藻会相应对EPS及各组分的含量进行调控。
3.EPS对莱茵衣藻砷富集和形态转化的影响
在上述研究基础上，首先研究不同浓度砷酸盐As(Ⅴ)和亚砷酸盐As(Ⅲ)对莱茵衣藻的生长及EPS的影响规律，然后研究离心法、氢氧化钠法、EDTA法和加热法对莱茵衣藻EPS提取后，微藻的生长情况。选择不影响去除EPS后微藻生长的提取方法，研究有无EPS的莱茵衣藻对As(Ⅴ)的代谢转化规律。
结果表明:在不同浓度的As(Ⅴ)和As(Ⅲ)处理下，微藻的生长没有明显地变化，随着培养液中五价砷浓度的增加，EPS的产量有降低趋势，而As(Ⅲ)处理则对EPS的产生没有影响;使用离心法和EDTA法对微藻的EPS进行提取后，对其生长没有造成影响，而使用氢氧化钠法和加热法则会显著抑制微藻的生长;对比有无EPS的莱茵衣藻对As(Ⅴ)的代谢转化规律，研究发现无EPS的莱茵衣藻对As(Ⅴ)的还原能力显著降低，而且在6h内，对砷的富集和吸收没有明显变化，但无EPS的莱茵衣藻对砷的吸附比例(43.03％～66.23％)显著高于有EPS的莱茵衣藻(10.68％～31.90％)，说明无EPS的莱茵衣藻对砷的吸附效率增加。因此我们认为莱茵衣藻的EPS在砷的富集和形态转化过程中起着重要作用。
通过上述研究，优化并建立了莱茵衣藻EPS的提取方法，系统探讨了不同外界环境因素对莱茵衣藻的生长和EPS的影响规律，阐明了EPS在微藻对砷的富集代谢过程中的作用。
1.莱茵衣藻EPS的提取与表征
采用加热法、NaOH法、EDTA法、阳离子交换树脂(CER)法、高速离心法提取莱茵衣藻的EPS，比较分析每种方法得到的EPS的含量及其组成成分，并结合LIVE/DEAD BacLight染色和激光共聚焦显微镜观察细胞活性，以确定莱茵衣藻EPS最适宜的提取方法。
结果表明，不同提取方法得到的EPS各组分含量有显著差异，5种方法的提取总量从多到少依次为:NaoH法＞加热法＞CER法＞EDTA法＞离心法。当NaOH浓度为1mol.L-1时，EPS的提取量达到111.87±0.91mg·g-1，但NaOH提取导致细胞破裂，DNA含量显著增加;当加热温度为50℃时，EPS提取量为40.06±0.30mg·g-1，荧光染色和激光共聚焦显微镜检测结果表明，加热法对微藻细胞的破坏程度较小，并且提取效率较高、操作简单，因此确定加热法为莱茵衣藻EPS的最适宜提取方法。
傅里叶红外光谱分析结果表明，加热法提取的EPS出现N-H、C=O或C-N(蛋白质)和C-H、C-O-C、RHC(OH)(OR)(糖类)等吸收峰，为后续研究微藻EPS与重金属之间的相互作用提供了理论依据。
2.不同环境因素对莱茵衣藻EPS的影响
采用实验室培养，研究不同生长阶段、磷酸盐浓度、TAP培养基浓度、溶液pH、铜浓度对莱茵衣藻的生长情况、EPS以及各组分含量的影响规律。
结果表明，在微藻的不同生长阶段，其生长情况和微藻所分泌的EPS的总量及各组分含量有显著差异，当微藻生长至稳定期时(96h)，EPS含量相对较高(40.9mg·g-1)，DNA占EPS百分最低(0.93％)，因此，在96h进行EPS的提取效果最佳。不同营养盐对莱茵衣藻的影响十分显著。处于低磷条件下的莱茵衣藻会通过分泌大量蛋白质来抵御该胁迫，相反在磷浓度较高时，微藻则会产生更多的多糖类物质;而当TAP培养基浓度过高或过低时，均会抑制莱茵衣藻的生长。提高培养基的浓度，藻细胞会通过增加蛋白同时降低多糖的产量来抵御该胁迫。相反，当降低培养基的浓度，会显著降低EPS的分泌量。改变溶液酸度(pH值)会影响微藻的生长，随着溶液pH的升高，微藻会通过提高蛋白并降低多糖的含量应对该环境胁迫。随着铜浓度的增加微藻的生长也受到显著抑制，并且会刺激藻细胞产生更多的多糖。综上所述，面对外界环境的改变，莱茵衣藻会相应对EPS及各组分的含量进行调控。
3.EPS对莱茵衣藻砷富集和形态转化的影响
在上述研究基础上，首先研究不同浓度砷酸盐As(Ⅴ)和亚砷酸盐As(Ⅲ)对莱茵衣藻的生长及EPS的影响规律，然后研究离心法、氢氧化钠法、EDTA法和加热法对莱茵衣藻EPS提取后，微藻的生长情况。选择不影响去除EPS后微藻生长的提取方法，研究有无EPS的莱茵衣藻对As(Ⅴ)的代谢转化规律。
结果表明:在不同浓度的As(Ⅴ)和As(Ⅲ)处理下，微藻的生长没有明显地变化，随着培养液中五价砷浓度的增加，EPS的产量有降低趋势，而As(Ⅲ)处理则对EPS的产生没有影响;使用离心法和EDTA法对微藻的EPS进行提取后，对其生长没有造成影响，而使用氢氧化钠法和加热法则会显著抑制微藻的生长;对比有无EPS的莱茵衣藻对As(Ⅴ)的代谢转化规律，研究发现无EPS的莱茵衣藻对As(Ⅴ)的还原能力显著降低，而且在6h内，对砷的富集和吸收没有明显变化，但无EPS的莱茵衣藻对砷的吸附比例(43.03％～66.23％)显著高于有EPS的莱茵衣藻(10.68％～31.90％)，说明无EPS的莱茵衣藻对砷的吸附效率增加。因此我们认为莱茵衣藻的EPS在砷的富集和形态转化过程中起着重要作用。
通过上述研究，优化并建立了莱茵衣藻EPS的提取方法，系统探讨了不同外界环境因素对莱茵衣藻的生长和EPS的影响规律，阐明了EPS在微藻对砷的富集代谢过程中的作用。