一氧化氮(nitric oxide,NO)是一种具有保护与杀伤双重生理功能的信号分子,它对于雄性生殖也具有双重调节作用。睾丸支持细胞(sertoli cell,SC)骨架结构的完整是维持精子生成的前提和基础。许多药物进入睾丸内都有可能会产生过量NO,而睾丸中的SC最易受到这些药物的影响。研究NO对SC骨架的影响及机制,不仅可以进一步认识精子生成的调节机制,丰富和完善雄性性腺的发育生物学机制,同时也可为治疗雄性不育奠定基础,还可以为药物的安全性评价提供依据。本实验以仔猪为研究对象,利用体外培养的SC,通过使用能产生NO的SNP处理细胞,模拟细胞内的NO环境从而构建合适的实验模型,观察NO对SC骨架结构和转铁蛋白分泌的影响。同时,我们还检测了SC内抗氧化水平以及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的活性。实验首先采用浓度分别为1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L和1 mmol/L的SNP处理SC 24h,结果发现随着SNP浓度的增加,SC内NO水平显著升高。NO水平在0.07±0.01～2.74±0.03μmol/L之间变化,不仅涵盖了正常的生理浓度,而且也包括了高于1μmol/L的浓度范围,同时排除了内源性的NO对本实验的影响。此外,实验还检测了不同浓度SNP处理SC 24 h对SC活力的影响,结果显示1μmol/L SNP组细胞活力较对照组上升了15.90%,差异显著(P＜0.05);当SNP浓度为10μmol/L、100μmol/L和1 mmol/L时,细胞活力较对照组分别下降了2.55%、12.36%和59.89%,其中100μmol/L和1 mmol/L SNP组与对照组相比差异显著(P＜0.05)。SC体外培养24 h后,加入含1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L和1 mmol/L SNP的培养液,培养结束后收集细胞进行蛋白提取和蛋白定量分析。经western blot检验,结果发现高浓度NO能提高SC内p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的活性,1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L和1 mmol/L SNP组p38MAPK的活性较对照组分别上升了15.38%、16.92%、36.92%和69.23%,差异显著(P＜0.05)。接着在体外培养24 h的SC中加入1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1 mmol/L SNP和1mmol/L SNP+20μmol/L SB203580(SB203580提前30 min加入)的培养液,通过细胞免疫荧光检测,实验发现1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L SNP和1mmol/L SNP+20μmol/L SB203580组细胞骨架中细而密集的微丝较为均匀地分布在细胞质中,网状结构清晰,较对照组无明显差异;而1mmol/L SNP组细胞内的微丝应力纤维网和微丝束被破坏,出现微丝边集化。同时,1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L SNP组细胞骨架中α-tubulin呈放射状排列在核外,较对照组无明显差异;而1mmol/L SNP组细胞内的微管网完全损坏,呈弥散形。此外,随着SNP浓度升高,转铁蛋白表达量呈下降的趋势,1μmol/L和10μmol/L SNP组细胞转铁蛋白表达量与对照相比差异不显著(P＞0.05)。当SNP浓度为100μmol/L和1 mmol/L时,细胞转铁蛋白表达量较对照组分别下降了15.79%和25.26%,差异显著(P＜0.05)。当细胞中同时加入1 mmol/L SNP和SB203580时,细胞的转铁蛋白分泌量较仅加入1 mmol/L SNP相比显著上升了30.99%(P＜0.05)。这表明NO在破坏细胞骨架的同时,也降低了细胞的分泌功能。与此同时,高浓度NO使SOD、GSH和T-AOC等水平显著下降,并激活了p38MAPK途径。综上所述,本实验可以得到如下结论:(1)本实验建立的细胞模型适用于研究NO对SC功能的影响;(2)低浓度的NO能保证细胞的存活,而高浓度的NO对细胞的存活和功能有损伤;(3) SNP处理使SC内NO的水平升高,降低了细胞抗氧化能力;并通过p38MAPK级联,使细胞内微丝发生聚集和区域化,微管发生解聚化,破坏了微丝和微管的正常结构,从而降低了细胞的分泌功能。