急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是一种以肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛受损伤为特征的失控性炎症反应。肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤致使肺组织内大量中性粒细胞积聚、肺间质水肿、肺泡腔内蛋白质渗漏等，上述因素可进一步加重原有的肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞损伤，临床出现严重的低氧血症和（或）高碳酸血症，严重者可致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)，病死率高达40％。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是真核生物中由小分子干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)利用细胞内自然信号通路介导的一种生物过程，通过识别和降解特异的mRNA序列从而达到转录后水平靶基因沉默的目的。因此，采用RNAi技术在转录后水平抑制ICAM-1的过度表达或许有助于减轻ALI时过度的炎症反应。保证siRNA发挥转录后基因沉默效果的前提要克服目前存在的RNAi应用过程中面临的诸多问题，如siRNA及其传递载体的低生物相容性、不稳定性、免疫原性和组织细胞毒性等。因此，选择一种理想的RNAs载体十分必要。外泌体(exosomes)是细胞内后期多泡内涵小体通过向内萌芽产生，然后与细胞浆膜融合释放到细胞外的一种纳米级颗粒，可以携带RNAs在细胞间穿梭，参与细胞行为调控，被认为是用于基因治疗的一种理想的RNAs载体。　　鉴于上述分析，课题组设计了本实验，研究的主要目的包括:(1)构建尿液细胞来源的iPSCs，鉴定iPSCs。(2)分离纯化iPSCs来源外泌体，观察外泌体的形态外观、粒子浓度、直径大小和分布范围、特征蛋白表达以及靶细胞摄取情况。(3)将合成的靶向ICAM-1的siRNA封装至iPSCs外泌体，观察其对LPS致肺微血管内皮细胞ICAM-1表达和PMNs粘附的影响。　　文章分为以下部分:　　第1部分 尿液细胞来源诱导多潜能干细胞重编程及多能性鉴定　　本部分的实验目的是根据本课题组先前报道的方法收集健康男性志愿者尿液中脱落的上皮细胞，采用episomal质粒将重编程转录因子Oct4、Sox2、Klf4及Myc导入上皮细胞对其进行重编程，建立iPSCs细胞系，体外培养扩增。　　明场下观察iPSCs克隆生长的形态，并对iPSCs进行核型分析。重编程1周左右可以看到有形变的小克隆出现，继续在重编程培养基里培养，克隆变大且更加致密，呈现典型的ES样克隆，挑取iPSCs单克隆继续培养，iPSCs生长状况良好，呈现出典型的多潜能干细胞形态:高核质比，克隆结构紧密、边缘清晰。染色体组核型分析结果显示iPSCs染色体组为46条染色体构成的XY型正常染色体组。　　采用碱性磷酸酶染色及干细胞多能性相关标志物免疫荧光染色法鉴定iPSCs多能性。与hESC-H9对照相比，iPSCs同样显示出高水平的碱性磷酸酶活性。细胞免疫荧光染色结果显示iPSCs表达人类干细胞多能性相关标志物Oct4、Sox2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和Nanog。　　采用畸胎瘤实验评价iPSCs体内分化能力。iPSCs在免疫缺陷小鼠注射部位形成肿块，2个月左右切除肿瘤，组织切片HE染色后镜下可见三胚层来源的组织成份，包括内胚层（腺体组织），中胚层（软骨组织）和外胚层（神经管组织）。　　第2部分 iPSCs外泌体分离纯化、鉴定及体外摄取实验　　本部分实验目的是在体外无饲养层、无血清条件下培养扩增iPSCs。收集细胞条件培养基(conditioned mediuim，CM)，采用差速超速梯度离心法分离纯化条件培养基中的外泌体(exosomes，Exo)并进行鉴定。　　采用磷钨酸负染透射电镜(transmission electron microscopy，TEM)观察iPSCs外泌体形态外观大小一致，呈圆形杯状外观，直径50-200 nm。　　纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)和可控电阻脉冲传感技术（tunable resistive pulse sensing，TRPS）对iPSCs外泌体的粒子浓度、直径大小及分布情况进行分析。NTA结果显示iPSCs外泌体样本的粒子浓度为4.69×108/ml，粒子D10～D90直径范围为46 nm～166 nm，平均粒子直径为122 nm。TRPS结果显示所测样本的粒子浓度为3.57×109/ml，粒子D10～D90直径范围为81nm至208nm，平均粒子直径为132 nm。　　蛋白质免疫印迹技术证实iPSCs外泌体表达外泌体特征蛋白CD63、TSG101及Alix。　　细胞吞噬实验证实PKH26标记的iPSCs外泌体可以被肺微血管内皮细胞时间依赖性摄取。　　第3部分 iPSCs外泌体介导siRNA传递抑制ICAM-1表达及中性粒细胞粘附　　本部分实验目的是将体外合成靶向细胞粘附分子1(intercellular adhesionmolecule1，ICAM-1)的siRNA封装进入iPSCs外泌体中形成外泌体-siRNA复合物（Exo-siRNA compound）。观察不同浓度的Exo-siRNA复合物对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）致人肺微血管内皮细胞(primary human pulmonarymicrovascular endothelial cells，PMVECs)的ICAM-1表达及多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)粘附的影响。实验分组如下:①空白对照组（Control）:PMVECs体外培养24小时后，不做任何处理;②LPS处理组(LPS):PMVECs体外培养24小时后，LPS(100 ng/ml)刺激6小时;③Exo-ScrsiRNA组（Scr siRNA）:Exo-Scr siRNA10μg与PMVECs共培养24小时后，LPS(100 ng/ml)刺激6小时;④Exo-siRNA2μg组(Exo-siRNA2μg):Exo-siRNA2μg与PMVECs共培养24小时后，LPS(100 ng/ml)刺激6小时;⑤Exo-siRNA5μg组（Exo-siRNA5μg）:Exo-siRNA5μg与PMVECs共培养24小时后，LPS(100 ng/ml)刺激6小时;⑥Exo-siRNA10μg组(Exo-siRNA10 ug):Exo-siRNA10μg与PMVECs共培养24小时后，LPS(100 ng/ml)刺激6小时;⑦micropoly-sirRNA100 nM(micropoly100 nM):micropoly-siRNA100 nM处理PMVECs24小时后，LPS(100 ng/ml)刺激6小时。　　经12个小时共培养，Exo-siRNA处理组细胞胞浆内可成功检测到cy3标记siRNA的荧光信号，且高蛋白浓度Exo-siRNA处理组的荧光信号强度较低蛋白浓度组高。流式分析结果显示PMVECs浓度依赖性摄取Exo-siRNA复合物，cy3阳性细胞比例5μg蛋白浓度组为30.2％，10μg蛋白浓度组为92.9％。　　PCR结果显示，与对照组相比，LPS(100 ng/ml)刺激细胞6小时可导致细胞ICAM-1 mRNA表达水平明显升高（＞20倍），10μg蛋白浓度Exo-siRNA复合物可以显著抑制LPS介导的细胞ICAM-1 mRNA表达水平升高(＞65％)。　　Western Blot结果显示，LPS未处理组PMVECs的ICAM-1蛋白表达水平很低，LPS(100 ng/ml)刺激6小时后，细胞ICAM-1蛋白表达水平明显升高。与单纯LPS处理组相比，10μg蛋白浓度Exo-siRNA复合物可显著抑制LPS导致的细胞ICAM-1蛋白表达水平升高(＞55％)。　　免疫荧光结果显示，与对照组相比，100 ng/ml浓度的LSP刺激PMVECs6小时可导致细胞ICAM-1膜表达水平明显升高（＞2.3倍）。与单纯LPS处理组相比，10μg蛋白浓度Exo-siRNA复合物可明显减轻LPS介导的细胞ICAM-1膜表达量的增加。　　MPO活性检测显示，与单纯LPS处理组相比，10μg蛋白浓度Exo-siRNA复合物可功能性地将PMNs-PMVECs粘附水平降低59.2％。　　通过本实验可以发现　　1.使用episomal载体可成功将重编程转录因子引入尿液细胞将其重编程为iPSCs。　　2.尿液细胞重编程产生的iPSCs染色体组核型正常，具备多向分化潜能和体内分化能力。　　3.采用差速-超速梯度离心法可从iPSCs培养基中分离纯化外泌体。　　4.iPSCs外泌体的外观形态，粒子浓度、直径大小和分布，特征蛋白表达与其它细胞来源的外泌体基本一致，且可被靶细胞摄取。　　5电转法和化学试剂均可将外源目的siRNA封装至iPSCs外泌体。　　6.一定蛋白浓度装载有siRNA的iPSCs外泌体可抑制LPS致肺微血管内皮细胞ICAM-1 mRNA表达、蛋白合成、膜表达及中性粒细胞-内皮细胞粘附。