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三氯乙烯(TCE)作为一种重要的有机溶剂被广泛应用,但其不当处理造成了地下水环境的严重污染。自1997年Dehalococcoides ethenogenes strain195被发现以来,产乙烯脱卤拟球菌(Dehalococcoides spp.)被证实是目前唯一能将TCE彻底还原脱氯为无毒产物乙烯的菌属。Dehalococcoides spp.以氢作为最终电子供体,电子供给的成本高、操作难和修复周期长是该生物技术实际应用所面临的主要问题。天然矿物材料电气石(Tourmaline)能够自发产生永久性静电场,可能对Dehalococcoides spp.的细胞代谢产生刺激作用,电场作用下的水电解产氢亦为脱氯菌潜在的理想电子供体。这种矿物自发电刺激和原位供氢的方式为生物修复TCE污染提供了一条绿色强化的新思路。基于此,本文将Dehalococcoides spp.混合脱氯菌群作为研究对象,以异极性矿物电气石作为强化介质材料,利用化学分析结合分子生物学技术研究生物降解TCE过程中加入电气石对降解性能、群落结构演替及脱氯菌增殖与基因表达的影响,探究电气石对脱氯菌群产生的生物效应和强化作用机制,所得主要结论如下: 1)电气石可调节水体pH并降低氧化还原电位以利于Dehalococcoides spp.的还原脱卤作用,同时增加水体电导率以促进微生物的代谢。电气石加入混合菌液中,可同时加快由TCE依次脱氯为顺-1,2-二氯乙烯(cis-DCE)、氯乙烯(VC)和乙烯过程中各步的降解速率,尤其明显强化了由VC向乙烯转化的生物脱氯限速步骤,而对降解路径无影响。投入1、5和10g·L-1电气石分别能使TCE完全降解的时间从120h缩短至108、84和84h,并均能在204h内将cis-DCE完全降解;且不同于空白体系中VC含量直至468h测定结束时仍未出现下降趋势,各电气石体系中VC含量均可在cis-DCE被完全降解时达到最大值,并开始下降。其中5g·L-1电气石体系不仅分别在84h和120h内即可将TCE和cis-DCE降解完,且能在468h完全除尽有毒中间产物VC,此时体系中乙烯产量较空白体系增加51.58%。 2)通过PCR-DGGE分析发现,在厌氧脱氯菌群降解TCE的过程中物种多样性变化不大;电气石的加入在一定程度上推动了菌群群落结构的演替,主要表现为加快部分条带的出现与消失,且这种影响随电气石投加量的增加而愈发明显。利用Quantity One软件分析可知,1d时10g·L-1电气石体系群落变化相对较大,而在15d时各电气石体系群落结构相似。据戴斯系数Cs两两对比1d与15d所有样品的最小相似度达62.80%,可见电气石的加入与否以及加入量的大小,对厌氧混合菌群降解TCE前、后期群落结构变化的影响不明显。混合脱氯菌群的组成以绿弯菌门(Chloroflexi)的产乙烯脱氯拟球菌属(Dehalococcoides)为主,此外还含有厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、互养菌门(Synergistetes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)等;电气石的加入对体系菌群的物种多样性无明显影响,且具有促进功能菌增殖、维持群落稳定的能力。 3)电气石可明显促进并维持Dehalococcoides spp.的快速增殖,其中电气石投加量为10g·L-1的体系在1d内脱氯菌已开始显著增殖,此时1g·L-1和5g·L-1体系脱氯菌含量与空白体系相近。不同体系中Dehalococcoides spp.在第1d至7d期间均快速增殖,并以5g·L-1体系的增殖速度最快;各体系在7d时的脱氯菌量随电气石浓度的增加而增大。脱氯中后期空白和10g·L-1体系增殖速度明显减缓,1g·L-1和5g·L-1体系中的脱氯菌量依旧保持快速增长并超过10g·L-1体系;1、5和10g·L-1电气石体系在15d时Dehalococcoides spp.菌量分别高出空白体系菌量的90.00%、107.85%和68.58%。利用TEM分析发现,5g·L-1电气石与产乙烯脱卤拟球菌群接触15d后,体系菌体数量增多、各细胞接触紧密,电气石有明显的吸附作用,可造成菌体富集。 4)定量分析分别编码了两种还原脱卤素酶的tceA和vcrA基因发现,1g·L-1和10g·L-1电气石体系在TCE被完全降解前的tceA基因表达水平与空白体系相近,vcrA基因表达水平则在VC迅速增加的过程中超过了空白体系;而5g·L-1体系中tceA和vcrA基因表达水平一直保持较高状态。电气石体系相比于空白体系功能基因的表达水平总体上更高,且在各剂量下对vcrA基因的强化作用较tceA基因明显。研究进一步选取强化效果较好的5g·L-1电气石组,并以同时期的空白样品为对照进行相对基因表达率(rER)的分析,电气石投入1d时tceA的rER为92.24%,略低于空白体系,之后随TCE较空白体系更快的降解而迅速下降。而vcrA相对基因表达率在1d时为空白体系的105.07%,随后也表现出迅速的降低并稳定于77%左右。电气石组中tceA和vcrA相对基因表达率基本上均较空白组更低,电气石的加入推动了tceA和vcrA基因表达的下降。 综上所述,电气石对产乙烯脱卤拟球菌群还原降解三氯乙烯起促进作用,可明显地推动中间产物向终产物转化的限速步骤。此过程中,电气石在保持功能菌的优势地位的同时一定程度上推动了脱氯菌群的演替,并具有促进Dehalococcoides spp.持续增殖以维持脱氯后期菌群相对稳定的能力。此外,在TCE的还原脱氯过程中电气石从整体上来说提高了功能基因tceA和vcrA的表达水平,并推动了tceA和vcrA表达率的下降。