结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病例约800万人，占所有恶性肿瘤的10％～15％;在欧美发达国家居恶性肿瘤发病率的前列，仅次于肺癌居肿瘤死亡原因的第二位。我国的研究显示，结肠癌发病率近年来呈明显上升趋势，结肠癌发病率和死亡率分别为28.08/10万和13.41/10万，分别占恶性肿瘤发病率和死亡率的第3位和第5位。虽然目前常规的治疗手段在一定程度上缓解了病人的痛苦，延长了病人的生存时间，但还存在不少缺陷，如对于晚期患者，手术无能为力，而且创伤大，而化学治疗则面临越来越频繁的耐药难题，药物的毒副作用也使其临床应用受到了限制。因此，寻找低毒高效的抗肿瘤药物是当今抗肿瘤研究的热点，研发新的抗结肠癌药物具有重要的现实意义。中医药治疗肿瘤历史悠久，是中华民族文化遗产的重要组成部分。应用中医药与中西医结合治疗结直肠癌等恶性肿瘤已经越来越被广大肿瘤专业医生和病人所接受，是目前结肠癌综合治疗中的重要组成部分之一。现在临床上主要应用于手术后、放疗化疗期间的减毒增效、西医治疗间歇期的巩固治疗、晚期肿瘤的扶正治疗，中医药都有积累了很多宝贵的经验。临床实践证实，中医药和中西医结合治疗恶性肿瘤有以下优势:①有效改善临床症状和生存质量，提高5年生存率;②加快术后的恢复如促进肛门排气，降低术后并发症如腹部手术后肠粘连;③对放疗和化疗期间合用有减毒增效作用;④提高人体免疫力，预防肿瘤复发转移。中药是新药研发中的重要领域，许多中药由于其低毒性及其巨大药用价值，更是被广泛用于药物筛选。中药作为抗癌药物已愈来愈受到重视，许多中药活性成分及其分子靶点也已被鉴定。由于作用机制独特，一些中药活性成分对某些癌症不仅表现出高度特异性及良好抗癌效果，而且毒副作用轻微，因此已成功进入临床并且在肿瘤治疗实践中发挥了重要甚至关键作用，如紫杉醇及其衍生物的发现就是极佳证明。根据现代科技手段开发了很多中药抗癌新药已经在临床上广泛使用，如惹苗仁提取物康莱特注射液，复方斑鳌提取物艾迪注射液，香菇多糖注射液，黄茂多糖注射液等，以及提高免疫力的中成药:补中益气颗粒，河车大造胶囊，养血饮等都与放化疗合用。有关中西医结合治疗结直肠癌等肿瘤的临床报道很多，清热解毒，扶正固本、活血化淤等是常用疗法，虽然单独使用中药抑瘤效果不及放化疗，但是不良反应较少，它所具有的扶正作用和个体化治疗是放化疗所不能及的。　　 半边旗（Pteris Semipinnata L），别名半边蕨、单片锯、半边牙、半边梳、半边风药，系凤尾蕨科植物，为南方民间常用中草药，始载于《岭南采药录》，性味苦、辛，凉，归肝经、大肠经，具有清热解毒，消肿止痛的功效，常用于治疗肠炎、菌痢、肝炎和结膜炎等。课题组经研究发现半边旗的水提物和醇提物均能有效抑制肿瘤细胞的生长，对小鼠移植瘤有明显抑制作用。通过对半边旗粗提取物的分离纯化得到具有强抗肿瘤活性的贝壳杉烷型二萜类化合物5F（ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-olic acid）]。目前已发现半边旗提取物5F对白血病、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌和胰腺癌等多种癌细胞有明显抑制作用，对小鼠S180肉瘤、淋巴肉瘤及HepA肝癌均有明显抑制作用，能降低NNK诱导的肺癌和DEN诱导的肝癌的数量和大小。其抗肿瘤机制可能与诱导癌细胞凋亡、细胞周期阻滞有关;可抑制NF-κB信号通路，从而抑制癌基因Bcl-2和Bcl-xL的表达，刺激诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，下调增殖相关蛋白(Cyclin D1、COX-2和EGFR)和凋亡相关蛋白(Survivin)的表达，促进凋亡抑制蛋白Bax表达，诱导癌细胞死亡;通过p53介导的线粒体途径，促进Bax基因表达，使线粒体释放细胞色素C及凋亡诱导因子(AIF)到胞浆，引起细胞凋亡;影响MAPK通路的ERK1/2、JNK和p38基因的表达，从而调控细胞凋亡和细胞周期;对高转移卵巢癌、高转移肺癌等癌细胞有降低其侵袭和转移能力的作用，这与下调VEGF、MMP-9和uPA表达，上调PTEN的表达有关。这些实验结果提示了5F在抗肿瘤应用中的广泛前景，为5F的开发利用提供了可靠的实验依据。尽管5F在药效学及其作用机制的研究中做了大量的工作，但其确切作用机制仍未明确。因此我们希望进一步深入研究半边旗提取物5F在体内外对结肠癌的作用并探讨其作用机制，为5F作为结肠癌的预防或治疗用药提供理论和实验依据。本研究分为四个部分：　　 第一章：5F对C26结肠癌细胞增殖的影响。　　 目的：观察5F对结肠癌细胞株C26细胞生长抑制情况。　　 方法：采用台盼蓝染料排斥实验测定不同浓度的5F干预24、48和72h后对细胞生长的影响;四唑盐(MTT)分析法来检测其对细胞活力的影响;[3H]-胸腺嘧啶掺入实验分析其对细胞DNA合成的影响。实验结果主要采用单因素方差分析(ANOVA)比较组间差异，方差齐时采用Tukey HSD进行多重比较，方差不齐采用Tamhanes T2进行多重比较，多因素采用析因分析比较各处理方式的主效应及交互效应。P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果：⑴在台盼蓝染料排斥实验中，5F能够显著抑制C26细胞的增殖，且呈现剂量依赖关系和时间依赖关系。5、10、20、40和80μg/ml5F作用24h，细胞生长抑制率分别为4.75±3.38％、15.13±8.26％、40.72±3.39％、68.52±4.27％和87.16±6.73％，10、20、40和80μg/ml剂量组与对照组相比差异具有显著性;作用48h，细胞生长抑制率分别为28.48±8.22％、52.78±4.36％、66.37±3.56％、81.16±6.22％和95.62±3.62％，差异具有显著性;作用72h，细胞生长抑制率分别为40.71±4.37％、62.79±3.23％、81.78±5.57％、96.19±2.29％和98.95±0.61％，差异具有显著性。⑵MTT分析实验显示，5F能够显著抑制细胞活力水平，且呈现剂量依赖关系和时间依赖关系。5、10、20、40和80μg/ml5F作用24h，细胞活力抑制率分别为2.75±2.38％、8.57±5.68％、37.12±6.38％、75.65±5.97％和87.64±3.75％，10、20、40和80μg/ml剂量组与对照组相比差异具有显著性;作用48h，细胞活力抑制率分别为25.59±7.61％、55.91±5.75％、76.14±4.38％、89.06±3.22％和97.22±0.24％，10、20、40和80μg/ml剂量组与对照组相比差异具有显著性;作用72h，细胞活力抑制率分别为35.89±3.67％、68.29±1.11％、79.18±2.98％、90.89±3.29％和97.95±0.12％，差异具有统计学意义。⑶[3H]-胸腺嘧啶掺入实验表明，5F可以显著抑制C26细胞DNA合成，且呈现时间依赖关系和剂量依赖关系。5、10、20、40和80μg/ml5F孵育24h，C26细胞的DNA合成率分别为DMSO对照组的96.01±6.35％、89.34±5.29％、70.12±5.53％、41.57±1.92％和29.23±6.73％，10、20、40和80μg/ml剂量组与对照组相比差异具有显著性;孵育48h，细胞DNA合成率分别为DMSO对照组的85.79±3.96％、61.08±8.13％、32.22±4.72％、18.83±2.08％和10.78±1.29％，差异具有显著性;孵育72h，细胞DNA合成率分别为对照组的72.37±2.62％、51.98±6.21％、26.53±1.99％、10.41±4.23％和6.54±2.04％，差异有统计学意义。　　 结论：5F能够显著抑制C26细胞的增殖、细胞活力以及DNA合成，并呈现剂量依赖关系和时间依赖关系。　　 第二章：5F对C26结肠癌细胞周期、细胞凋亡及相关调控蛋白的影响。　　 目的：观察5F对结肠癌细胞株C26细胞周期和细胞凋亡的影响，并检测细胞周期调控蛋白和细胞凋亡调控蛋白的变化，初步探讨5F抑制C26细胞生长的可能机制。　　 方法：对细胞进行PI染色，利用流式细胞仪检测细胞的DNA含量，进而评价5F对C26细胞周期分布的影响。使用annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，通过流式细胞仪定量分析磷脂酰丝氨酸外翻程度从而检测5F作用后细胞凋亡比例的变化。进行Western blot实验，分析细胞周期相关蛋白以及细胞凋亡相关蛋白表达量的变化。使用caspase-3、caspase-8和caspase-9分光光度法检测试剂盒，通过酶标仪检测caspase-3、caspase-8和caspase-9活性。对细胞周期及凋亡相关蛋白CDK1、Cyclin B1、p21、p53、Bax、Bcl-2和caspase-3、8、9结果的比较采用独立样本T检验，其余实验结果采用单因素方差分析(ANOVA)比较组间差异，若方差不齐，采用校正的F检验Welch法代替。多重比较方差齐时采用Tukey HSD，方差不齐采用Tamhane sT2。P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果：⑴5F能够诱导C26细胞发生G2/M周期阻滞，而且这一效应具有剂量依赖性和时间依赖性。10μg/ml和20μg/ml5F孵育24h，G2/M期比例由9.60±1.32％分别升高到15.49±1.70％和35.20±4.80％;孵育48h，G2/M期比例由6.59±1.27％分别升高到19.37±5.80％和41.75±3.94％，差异有统计学意义。20μg/ml5F孵育6h、12h、24h和48h后，G2/M期比例由8.81±1.99％分别上升到16.47±1.33％、21.61±2.07％、33.14±3.26％和40.06±3.82％，差异具有显著性。⑵C26细胞经annexin V-FITC/PI双染后，流式细胞仪分析显示，C26细胞分别与5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml5F孵育24h后，晚期凋亡细胞所占比例分别为1.98±0.46％、4.33±0.58％、7.93±0.31％和8.07±0.80％，早期凋亡细胞所占比例分别为4.33±0.78％、5.05±0.52％、8.53±0.46％和17.08±0.75％，发生早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例分别从5.15±0.46％升高到6.32±0.58％、9.38±0.90％、16.47±0.59％和25.15±1.20％，差异具有显著性。⑶20μg/ml5F孵育24h，CDK1、Cyclin B1的表达降低，CDK1的表达水平为对照组的73.10±6.95％，Cyclin B1的表达水平为对照组的62.45±5.73％;p21、p53的表达增加，p21的表达水平为对照组的254.17±26.95％，p53的表达水平为对照组的704.90±15.73％; Bax蛋白表达水平为对照组的414.94±18.95％，Bcl-2蛋白表达量为对照组的46.90±5.73％，Bax/Bcl-2比例由0.95升高到8.45; caspase-3活性由0.211±0.067增加到0.398±0.095，caspase-9活性由0.201±0.039增加到0.518±0.084，差异具有统计学意义。caspase-8的活性没有明显变化。　　 结论：①5F能够诱导C26细胞发生G2/M周期阻滞，而且这一效应具有剂量依赖性和时间依赖性。②5F能够诱导C26细胞凋亡，而且这一效应具有剂量依赖性。③5F使细胞周期关键调控蛋白CyclinB1和CDK1蛋白表达降低，抗凋亡的Bcl-2蛋白表达量下调而促进凋亡Bax蛋白表达量上升，导致Bax/Bcl-2比例升高，p21和p53的表达增加，caspase-3和caspase-9活性增加而caspase-8的活性没有明显变化。　　 第三章：5F抗癌作用与cAMP信号传导通路的关系研究。　　 目的：观察5F对C26结肠癌细胞环磷酸腺苷(cAMP)水平的影响，探讨该变化与5F抗肿瘤作用之间的关系。　　 方法：以不同时间、不同浓度5F处理C26细胞，放免法测定cAMP含量。磷酸二酯酶抑制剂3-Isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)预先孵育后再与5F联合应用，放免法检测cAMP含量，MTT法检测C26细胞活力。统计方法主要为单因素方差分析(ANOVA)，多重比较方差齐时采用Tukey HSD，方差不齐时采用Tamhanes T2，多因素采用析因分析比较各处理方式的主效应及交互效应。P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果：⑴20μg/ml5F分别作用于C26细胞5、10、20和30min，cAMP含量分别为1.43±0.11 pmol/mg、1.77±0.16pmol/mg、2.13±0.12 pmol/mg和2.10±0.16pmol/mg，随着作用时间逐渐延长，cAMP含量逐渐增加，差异具有统计学意义。⑵5、10、20、40μg/ml5F作用于C26细胞20min，cAMP含量分别为对照组的116.08±7.27％、143.60±5.56％、166.76±9.28％和201.09±13.51％，随着5F剂量增加，cAMP含量逐渐提高，差异具有统计学意义。⑶最大剂量的广谱磷酸二酯酶抑制剂IBMX0.5 mM预先孵育15min，然后再加入不同浓度5F孵育15min，结果显示，0.5 mM IBMX组cAMP含量为对照组的251.72±12.70％(P＜0.01);5μg/ml和10μg/ml5F组cAMP含量为对照组的124.71±8.01％和163.51±8.02％(P＜0.01);而IBMX分别与5μg/ml、10μg/ml5F联合应用，cAMP含量分别为对照组的294.83±9.08％和341.38±14.24％(P＜0.01)，IBMX与5F两者之间没有交互效应。⑷0.5 mM IBMX预先孵育15min，然后再加入不同浓度5F孵育48h，结果显不，0.5 mM IBMX组细胞存活率为74.57±3.53％(P＜0.01)。与单独使用5F相比，5μg/ml5F和IBMX联合应用可以使C26细胞存活率由70.47±6.89％降低到55.28±1.45％(P＜0.01)，10μg/ml5F和IBMX联合应用可以使C26细胞存活率由43.83±2.66％降低到26.88±4.32％(P＜0.01)，IBMX与5F两者之间没有交互效应。　　 结论：①5F可以增加C26细胞cAMP含量，而且这一效应具有剂量依赖性和时间依赖性。②5F可能通过激活腺苷酸环化酶(AC)增加C26细胞cAMP含量。③在抑制C26细胞增殖方面，5F与IBMX没有交互效应。　　 第四章：5F对结肠癌动物模型肿瘤生长的影响。　　 目的：观察5F对C26结肠癌荷瘤小鼠和DMH/DSS诱导的结肠炎相关性结肠癌小鼠肿瘤生长的影响，以及5F对肝肾功能的影响，研究5F的体内抗肿瘤效应及毒副作用。　　 方法：通过腋下接种C26细胞建立结肠癌荷瘤小鼠模型，观察5F作用后小鼠体重和肿瘤重量的变化。联合应用致癌剂DMH和致炎剂DSS建立结肠炎相关性结肠癌模型，观察小鼠体重、肿瘤数量和大小的变化，检测血AST、ALT、BUN和Cr的含量。对DMH/DSS诱导的结肠癌模型中平均肿瘤数量和肿瘤大小的比较采用独立样本T检验，其余实验结果的比较采用单因素方差分析(ANOVA)比较组间差异，方差齐时采用Tukey HSD进行多重比较，方差不齐采用Tamhane sT2进行多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果：⑴C26结肠癌荷瘤动物模型:5F50mg/kg和100mg/kg剂量组实验动物治疗后的体重略高于模型组，但差异无统计学意义;在肿瘤重量方面，模型组平均瘤重为1.29±0.22g，5F50 mg/kg和100 mg/kg剂量组平均瘤重分别为0.76±0.19g和0.45±0.12，明显低于模型组，差异具有显著性。肿瘤抑制率分别为41.38％和64.87％。⑵DMH/DSS诱导的结肠炎相关性结肠癌模型:模型组小鼠共发现肿瘤49个，平均每只小鼠有肿瘤5.44±1.33个，肿瘤平均大小为3.22±1.1mm;5F组共发现肿瘤35个，平均每只小鼠有肿瘤3.5±1.08个，肿瘤平均大小为2.51±0.85mm，5F组肿瘤的数量和大小均低于模型组(P＜0.01)。⑶模型组和5F组小鼠AST分别为正常对照组的117.28±17.17％和109.8±18.75％，较正常对照组有所升高，但差异无统计学意义，ALT分别为正常对照组的135.11±24.88％和126.85±22.08％，明显高于正常对照组，差异有统计学意义，5F组与模型对照组相比，没有明显差异。另一方面，模型组和5F组小鼠BUN分别为正常对照组的99.48±7.12％和94.43±6.08％，Cr分别为正常对照组的106.89±21.63％和97.29±18.68％，与正常对照组基本一致。　　 结论：①5F可以抑制C26结肠癌荷瘤小鼠肿瘤的生长。②5F可以抑制DMH/DSS诱导的结肠炎相关性结肠癌小鼠肿瘤的生长。③5F不影响实验动物肝肾功能。