利用凡纳滨对虾原代细胞培养体系筛选具有免疫增强活性中药的研究

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凡纳滨对虾(Penaeus Vanmamei)是目前我国重要的水产养殖品种,养殖产量占全国对虾产量的80%以上。随着养殖规模和密度的增加,由水产病毒及病原菌诱发的对虾疾病日益频发,造成了不可估量的经济损失。目前的普遍办法是利用抗生素,但抗生素的广泛使用存在诱发病原菌耐药性、抗生素残留等问题。中药具有天然、高效、毒副作用小、抗药性不显著以及资源丰富等优点,常被用作佐剂提升机体的防御能力。因此,应用中药免疫增强剂有利于提升对虾免疫及抗病能力,及降低对虾的发病率及死亡率。但是,中药有成千上万种,加上配伍更是不计其数。在这么多中药中筛选出有效的中药是很困难的,因为目前还缺少高效的筛选系统。为此,本研究的目的旨在利用凡纳滨对虾原代细胞,结合中药抑菌效果,建立一套能筛选免疫增强活性中药的系统,其优点在于省时高效。  首先,测定了中药提取液对四种常见水产病原菌大肠杆菌(Escherichia coli, E. Coli)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus, Val)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, Ah)的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度,评价了30种中药的抗菌活性。结果表明,30种中药提取液中12种具有抗菌活性,抑菌活性具有广谱性;其中丁香、山萸肉、五味子、罗汉果和八角5种具有较强抑菌作用。  第二,成功优化了凡纳滨对虾肝胰脏细胞最佳培养条件:最适培养基为2×L-15,最适pH为7.6,添加1.2%NaCl、5%小牛血清、1000 IU/mL青霉素以及1000?g/mL链霉素,28℃下在5%CO2培养箱中培养。血淋巴细胞的最佳培养条件:最适抗凝剂为27 mM柠檬酸钠+337 mM NaCl+115 mM Glucose+9 mM EDTA·Na2,最适培养基为DMEM,28℃下在5%CO2培养箱中培养。  第三,基于所建立的凡纳滨对虾血淋巴和肝胰脏原代细胞培养体系,本文通过测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO)、谷胱甘肽-过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)活性,丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、超氧阴离子(Superoxide, O2-)水平以及细胞存活率,评价了30种中药提取液对体外细胞的细胞毒性及免疫增强作用。结果表明,黄连、五味子等提取液等可以激活proPO免疫体系,proPO、AKP、GSH-Px、SOD活性及O2-水平呈现不同程度的提升,但ACP活性无明显变化;然而过量的中药提取物会降低细胞存活率,造成脂质过氧化等细胞氧化损伤。  最后,基于以上免疫因子的活性数据以及灰色关联度的多目标决策模型,对30种中药的免疫调节能力进行综合评价,结果显示其中12种中药的综合评价值高于对照组,分别为丁香、五味子、黄芩、八角、山萸肉、紫苏叶、青蒿、豆蔻、黄连、升麻、大黄和泽泻。所筛选出的中药是对凡纳滨对虾具有免疫增强潜力的备选中药,可进一步开发利用。  综上所述,本研究不仅探究了30种中药提取物对常见水产病原菌的抗菌作用;而且建立了凡纳滨对虾的血淋巴和肝胰脏细胞的原代培养体系,并且应用于对其细胞毒性和免疫调节能力的评价,并在体外成功筛选出了低细胞毒性、高免疫增强活力和抗菌能力的中药免疫增强剂。这样就初步建立了一套能筛选免疫增强活性中药的系统,并在细胞层次上实现了对30种中药的筛选。
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