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凡纳滨对虾(Penaeus Vanmamei)是目前我国重要的水产养殖品种,养殖产量占全国对虾产量的80%以上。随着养殖规模和密度的增加,由水产病毒及病原菌诱发的对虾疾病日益频发,造成了不可估量的经济损失。目前的普遍办法是利用抗生素,但抗生素的广泛使用存在诱发病原菌耐药性、抗生素残留等问题。中药具有天然、高效、毒副作用小、抗药性不显著以及资源丰富等优点,常被用作佐剂提升机体的防御能力。因此,应用中药免疫增强剂有利于提升对虾免疫及抗病能力,及降低对虾的发病率及死亡率。但是,中药有成千上万种,加上配伍更是不计其数。在这么多中药中筛选出有效的中药是很困难的,因为目前还缺少高效的筛选系统。为此,本研究的目的旨在利用凡纳滨对虾原代细胞,结合中药抑菌效果,建立一套能筛选免疫增强活性中药的系统,其优点在于省时高效。 首先,测定了中药提取液对四种常见水产病原菌大肠杆菌(Escherichia coli, E. Coli)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus, Val)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, Ah)的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度,评价了30种中药的抗菌活性。结果表明,30种中药提取液中12种具有抗菌活性,抑菌活性具有广谱性;其中丁香、山萸肉、五味子、罗汉果和八角5种具有较强抑菌作用。 第二,成功优化了凡纳滨对虾肝胰脏细胞最佳培养条件:最适培养基为2×L-15,最适pH为7.6,添加1.2%NaCl、5%小牛血清、1000 IU/mL青霉素以及1000?g/mL链霉素,28℃下在5%CO2培养箱中培养。血淋巴细胞的最佳培养条件:最适抗凝剂为27 mM柠檬酸钠+337 mM NaCl+115 mM Glucose+9 mM EDTA·Na2,最适培养基为DMEM,28℃下在5%CO2培养箱中培养。 第三,基于所建立的凡纳滨对虾血淋巴和肝胰脏原代细胞培养体系,本文通过测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO)、谷胱甘肽-过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)活性,丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、超氧阴离子(Superoxide, O2-)水平以及细胞存活率,评价了30种中药提取液对体外细胞的细胞毒性及免疫增强作用。结果表明,黄连、五味子等提取液等可以激活proPO免疫体系,proPO、AKP、GSH-Px、SOD活性及O2-水平呈现不同程度的提升,但ACP活性无明显变化;然而过量的中药提取物会降低细胞存活率,造成脂质过氧化等细胞氧化损伤。 最后,基于以上免疫因子的活性数据以及灰色关联度的多目标决策模型,对30种中药的免疫调节能力进行综合评价,结果显示其中12种中药的综合评价值高于对照组,分别为丁香、五味子、黄芩、八角、山萸肉、紫苏叶、青蒿、豆蔻、黄连、升麻、大黄和泽泻。所筛选出的中药是对凡纳滨对虾具有免疫增强潜力的备选中药,可进一步开发利用。 综上所述,本研究不仅探究了30种中药提取物对常见水产病原菌的抗菌作用;而且建立了凡纳滨对虾的血淋巴和肝胰脏细胞的原代培养体系,并且应用于对其细胞毒性和免疫调节能力的评价,并在体外成功筛选出了低细胞毒性、高免疫增强活力和抗菌能力的中药免疫增强剂。这样就初步建立了一套能筛选免疫增强活性中药的系统,并在细胞层次上实现了对30种中药的筛选。