许多植物重要的性状、复杂的调控网络和代谢途径往往是多个基因相互作用的结果,因此将多个基因组装到一个双元载体上并导入植物中进行表达,对于基础理论研究和应用研究都具有重要价值。建立高效和标准化的DNA装配系统一直是合成生物学领域的努力目标之一。好的DNA组装系统必须要具有高度标准化的接口、非常简单的组装规则以及良好的兼容性。尽管CRISPR/Cas已经得到了广泛的应用,但是植物多基因突变体的高效产生仍是CRISPR/Cas系统应用的一个挑战。理论上使用多个sgRNA可以获得多基因同时突变的突变体,但过多的sgRNA会稀释Cas9蛋白,影响靶点识别和切割的效率。因此,使用两种或多种正交CRISPR/Cas系统(两种或多种CRISPR/Cas9系统同时互不干扰地在同一细胞中进行基因编辑)为解决这个挑战提供了新的策略。但是如何快速高效组装两种及以上CRISPR/Cas系统面临新的挑战。在本论文中,先后建立的 MISSA 2.0/3.0(Mu1tip1e-roundin vivo site-specific assemb1y 2.0/3.0)系统,为解决基因组编辑面临的挑战奠定了基础。MISSA 2.0是对本实验室以前报告的MISSA系统的优化。MISSA 2.0的供体系统是基于质粒RK2开发的新型的自杀供体载体系统,相比原来基于R6K质粒系统,它具有更高的克隆能力(>300kb)。新的供体载体系统与来自于质粒F和RK2的两套接合转移系统兼容。在MISSA 2.0中,本研究构建了新的、复制可控的、与农杆菌介导的转化相兼容的受体载体。同时还修饰了大肠杆菌的染色体,使之成为一个巨型受体载体。本研究中构建的新的供体菌株用于自杀式供体载体的复制和接合转移以及受体菌株用于MISSA2.0重组反应。通过组装多个DNA片段到大肠杆菌的染色体,以及通过组装多个表达框到双元载体,获得组成型或诱导表达多个基因的转基因拟南芥等方面对MISSA 2.0系统进行了验证。结果表明,R6K载体因容量的限制无法用于组装两种正交的CRISPR/Cas9系统,而使用大容量的RK2供体载体可以成功组装。通过3轮MISSA2.0组装,本研究将均受卵细胞特异性启动子驱动互不干扰的SpCas9和SaCas9系统以及6个sgRNA组装到受体载体上。随后对转基因植物的突变情况进行了分析。结果表明,载体的组装是正确的。为了进一步提高组装效率,本研究建立了 MISSA 3.0。MISSA 3.0技术不仅可以进行多轮组装,而且可以进行多片段组装,每轮可以同时组装3个片段,大大提高了组装效率。使用MISSA 3.0成功进行了 4轮共12个片段的组装。转基因拟南芥分析结果表明,这个载体是正确组装的。总之,本研究先后建立的MISSA 2.0及3.0系统有助于基于两种或两种以上的正交CRISPR/Cas9系统在多重基因组编辑领域的应用。