癌症,亦称恶性肿瘤,为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。我国肝癌发病人数约占全球的半数以上,占全球肝癌病人的55%,已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手。肝癌的转移是肝癌病人致死最主要的因素,同时,肝癌细胞异常的凋亡途径使肝癌细胞逃避凋亡,进一步促进了肝癌的转移和复发。因此,研究和探讨一种双重靶向治疗肝癌的新方法,为肝癌治疗提供新策略将有深远的意义。HAb18G/CD147分子作为我室鉴定的新型肿瘤靶分子,是CD147家族成员,高表达于肿瘤组织和一些转移性肝癌细胞的表面。研究表明HAb18G/CD147分子可以通过与整合素的结合,激活下游PI3K-Akt信号通路,促进肿瘤细胞自身基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的分泌,从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。本室前期用杂交瘤技术获得了针对HAb18G/CD147分子的鼠源性抗体HAb18,能够抑制HAb18G/CD147调控的相关功能。嵌合抗体hHAb18即为鼠源性抗体HAb18通过人源化改造而来。本研究一方面基于前期建立的具有在肿瘤细胞特异性复制的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)反向遗传学技术平台,构建表达hHAb18全长抗体基因的重组病毒rNDV-18HL,探讨抗体靶向治疗和溶瘤病毒治疗双效应系统对肝癌的抗肿瘤疗效,为肝癌治疗探索新手段。另一方面旨在比较rndv-18hl所表达人源化抗体hhab18和鼠源性抗体hab18与hab18g/cd147分子的亲和力,以及hhab18抗体与hab18g/cd147分子的结合特异性,并阐明hhab18封闭其靶点hab18g/cd147,从而抑制肿瘤细胞侵袭和转移的体内外作用和分子机制。本研究分为四部分:第一部分携带人源化抗体hhab18的重组新城疫病毒的构建及复活为实现肿瘤抗体靶向治疗与溶瘤病毒治疗的联合,我们首先从cho-ts28细胞中克隆得到hhab18抗体基因的全长序列,利用反向遗传学技术,构建包含hhab18抗体基因和ndvitalien株基因组的重组质粒,命名为pbr-rndv-18hl,测序验证正确。利用本室前期建立的重组病毒体外复活系统,将pcdna-np、pcdna-p和pcdna-l三个辅助质粒与pbr-rndv-18hl共转染bsr-t7/5细胞,成功复活表达hhab18的重组新城疫病毒,命名为rndv-18hl。用重组病毒感染bsr-t7/5细胞,westernblot检测结果显示,hhab18抗体能够在靶细胞中表达,特异性结合hab18g/cd147分子;利用elisa方法我们在细胞培养上清中也检测到hhab18抗体的分泌,且于病毒感染细胞第3天达到最大值,为7μg/ml。本部分研究结果表明:1)利用反向遗传学技术构建并复活了表达hhab18抗体的重组新城疫病毒,命名为rndv-18hl;2)该重组病毒rndv-18hl能够高效表达外源基因hhab18。第二部分人源化抗体hhab18和亲本鼠源性抗体hab18与肿瘤抗原分子hab18g/cd147的亲和力比较利用重组病毒rndv-18hl感染bsr-t7/5细胞后48h,收集细胞上清,并纯化病毒所表达人源化抗体hhab18。为检测该抗体与其亲本鼠源抗体hab18及cho-hhab18抗体(即cho-ts28细胞表达的hab18抗体)和肿瘤抗原分子hab18g/cd147的亲和力,我们利用表面等离子共振技术(surfaceplasmonresonance,spr),比较了两种抗体与其抗原的亲和力。spr结果显示,人源化抗体hhab18和其亲本鼠源性抗体hab18及cho-hhab18抗体与hab18g/cd147分子的亲和力一致,解离平衡常数kd分别为4.15×10-10mol/l、2.73×10-10mol/l和2.66×10-10mol/l。westernblot和细胞免疫荧光检测显示,hhab18和hab18抗体均可以与人肝癌细胞smmc-7721、hepg2和huh-7的膜分子hab18g/cd147特异性结合。通过台盼蓝染色、mtt和brdu检测的方法,筛选了hhab18抗体浓度为0.01、0.05和0.1mg/ml时,不会对肝癌细胞的增殖有显著影响(p>0.05);利用annexinv-fitc/pi和tunel标记的方法,激光扫描共聚焦显微镜和倒置显微镜观察显示,在确定的最高抗体浓度0.1mg/ml时,hhab18抗体亦不会引起细胞的凋亡。本部分研究结果表明:1)hhab18和hab18抗体与其抗原分子hab18g/cd147的亲和力一致;2)hhab18抗体能够与肿瘤细胞膜分子hab18g/cd147特异性结合;3)hhab18抗体以0.01、0.05和0.1mg/ml浓度作用于肿瘤细胞时,不会影响细胞的增殖,亦不会引起细胞的凋亡。第三部分人源化抗体hhab18抑制肝癌细胞侵袭运动的作用和分子机制hab18g/cd147分子已被证实与肿瘤的侵袭和转移密切相关。本部分研究通过人源化抗体hhab18特异性封闭肿瘤细胞膜分子hab18g/cd147,检测细胞侵袭和转移能力的变化,并进一步阐明抗体作用的分子机制。人工重组基底膜侵袭实验结果显示,与对照组相比,hhab18抗体可以显著性抑制smmc-7721细胞的侵袭能力(p<0.05,0.05mg/mlhhab18vscontrol;p<0.01,0.1mg/mlhhab18vscontrol);在明胶酶谱和real-timepcr的实验中,人急性单核白血病细胞thp-1的mmps分泌水平能被hhab18抗体抑制,smmc-7721细胞mmps的相对mrna水平也受到显著性抑制(p<0.01,0.05、0.1mg/mlhhab18vscontrol);进一步采用划痕实验证实,hhab18抗体能够在24h和48h分别抑制smmc-7721和smmc-7721-cd147/gfp肿瘤细胞(稳定过表达cd147/gfp融合基因的smmc-7721细胞)的运动能力,而单纯加入mmps的广谱抑制剂marimastat则不会影响细胞的运动能力,同时hhab18抗体亦不会影响cd147基因敲除细胞系smmc-k7721的侵袭和转移能力,以及mmps的相对mrna水平。该结果提示,hhab18抗体能够通过调节肿瘤细胞mmps的水平,抑制细胞的侵袭。而在细胞的运动机制中,hhab18抗体则通过另外的分子通路进行调节。随后,在细胞骨架形态观察的实验中,我们发现hhab18抗体分别作用细胞24h和48h后,smmc-7721细胞f-actin的张力丝和板状伪足的形成能力明显减弱,这一现象与smmc-k7721细胞f-actin的分布相似。利用westernblot的方法,我们分别检测了肿瘤细胞fak-pi3k-akt-girdin信号通路中各分子总蛋白及磷酸化水平的变化,发现hhab18抗体可以在2-5h内,抑制fak、pi3k、akt和girdin蛋白的磷酸化水平。我们进一步验证了hhab18抗体的体内抑瘤作用。首先建立裸鼠人肝癌细胞smmc-7721原位移植模型,小鼠手术后第5天开始腹腔注射hhab18抗体,一周两次,连续三周。待小鼠自然死亡,分别计算各组小鼠肝内转移灶数目,long-ranktest分析生存时间。研究结果显示,hhab18抗体随着剂量的增加,与生理盐水对照组相比,小鼠肝内癌转移灶数目显著减少(p=0.004),且10mg/kg体重的抗体治疗组与对照组相比,小鼠存活时间显著延长(p<0.001)。本部分研究结果表明:1)hhab18抗体具有抑制肝癌细胞体内、外侵袭转移的作用;2)hhab18抗体可以特异性地结合肿瘤细胞膜分子hab18g/cd147,抑制肿瘤细胞自身分泌mmps,进而抑制肿瘤细胞的侵袭;3)hhab18抗体通过对fak-pi3k-akt-girdin分子磷酸化的抑制,调节细胞骨架重排,降低肿瘤细胞的运动能力。第四部分重组新城疫病毒rndv-18hl病毒学特征及体外抗肿瘤研究为比较重组病毒rndv-18hl与野生型ndvitalien的病毒增殖动力学特征以及体外抗肿瘤特性,我们将rndv-18hl和ndvitalien分别感染工程细胞bsr-t7/5,以及3种人肝癌细胞系smmc-7721、hepg2和huh-7,通过tcid50方法检测病毒的增殖,mtt法检测病毒对靶细胞的杀伤作用。结果发现,与ndvitalien相比,插入外源抗体基因片段,对重组病毒rndv-18hl的病毒增殖能力及对肿瘤靶细胞的杀伤能力均没有产生显著性的影响(p>0.05)。为筛选制备重组病毒rndv-18hl的高产量细胞系,以便制备大量病毒,为后续临床前研究做准备,我们分别利用mtt和tcid50的方法,比较了该重组病毒对293-t、plat-e、x和y四株细胞的杀伤能力和病毒复制增殖能力。结果显示,x细胞对该病毒的耐受性最佳,且病毒在该细胞中的复制增殖能力最强,与其他三株细胞相比,均表现出显著性差异(p<0.01)。该结果提示,x可以作为临床前研究大规模制备重组病毒rndv-18hl的宿主细胞。本部分研究结果表明:1)利用反向遗传学技术构建并复活的重组新城疫病毒rndv-18hl,在高效表达有功能的外源基因hhab18的同时,其病毒复制增殖的能力和体外杀伤肿瘤的能力与其亲本毒株ndvitalien一致;2)x能够作为该重组病毒大规模制备的宿主细胞。全文研究表明,将该抗体作为外源基因,以溶瘤病毒ndvitalien株作为载体,利用反向遗传学技术平台和重组病毒复活系统,成功构建并复活重组新城疫病毒rndv-18hl,同时该病毒可以成功表达外源基因片段hhab18。纯化得到人源化抗体hHAb18,能够通过特异性封闭高表达于肿瘤细胞表面的HAb18G/CD147分子,抑制肿瘤细胞自分泌MMPs,从而抑制肿瘤细胞的侵袭能力;而细胞的运动能力主要由HAb18G/CD147分子调节FAK-PI3K-Akt-Girdin信号通路中各分子的磷酸化水平来实现,通过hHAb18抗体对靶分子的封闭,能够有效抑制细胞骨架F-actin张力丝和板状伪足的形成,从而抑制肿瘤细胞的迁移潜能。该重组病毒不仅具有体外抗肝癌细胞活性的能力,且插入外源抗体基因片段对病毒毒力和增殖能力均未产生显著影响。本研究为人源化抗体联合溶瘤病毒用于肿瘤治疗提供了新的思路。