研究背景:烧伤和各种原因造成的创伤以及糖尿病等缺血性疾病所引起的难愈性皮肤创面是临床治疗的难点问题。延迟愈合的创面最终还容易形成增生性瘢痕,从而导致机体不同程度的功能障碍。有效的创面修复需要在新生肉芽组织内生成大量的新生血管,来维持创面的营养及细胞外基质的沉积。因此创面组织中新生血管的生长对于肉芽组织的形成,改善创面微循环,减少感染的发生,促进慢性难愈创面或深度烧伤创面的愈合等起着非常重要的作用,其形成障碍将直接导致创面愈合延迟或愈合不良。因此进一步明确难愈性皮肤创面愈合的机理,促进其早期修复是创伤研究领域的焦点问题。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)参与了创面新生血管形成并发挥重要作用。EPCs有助于缺血或损伤后局部组织的再内皮化和增强血管形成能力,从而加速缺血肢体或创面的愈合,为创面愈合提供了一个新的研究策略和治疗方向。然而,EPCs参与新生血管形成的具体分子机制尚无定论,需要进一步研究。目前的研究结果证实骨髓来源的干细胞在骨髓中活化、动员,进一步归巢、迁移到受损或缺血组织的过程中可能涉及多种趋化因子的参与。高迁移率族蛋白B1(High mobility group box-1,HMGB1)是一种广泛存在的核内DNA结合蛋白,参与DNA的转录、复制、修复等。HMGB1可由坏死的细胞以及受LPS、TNF-α、IL-1等刺激后的炎性细胞主动释放或分泌到胞外,作为一种致炎因子引起炎症反应。除了诱导炎症反应之外,分泌到胞外的HMGB1还具有类似于趋化性细胞因子的功能,是细胞迁移普遍的调节因子。既往研究提示创面局部产生的各种炎症因子在诱导细胞迁移到损伤部位,促进创面修复过程中起着重要作用。结合HMGB1具有的趋化效应,对于创面局部HMGB1水平的升高是否能够对EPCs的迁移起着趋化性细胞因子的作用,使其达到创面局部并形成新生血管,促进皮肤缺损部位组织结构和功能的修复目前尚无太多的研究。文献报道HMGB1可促使胎鼠和成年鼠的血管相关干细胞中层成血管细胞穿过内皮细胞屏障,促进其迁移和增殖作用。基于以上证据我们假设在EPCs向皮肤创面迁移归巢和增殖分化过程中,除已知的SDF-1、VEGF等趋化因子外,创面炎症反应过程中释放的HMGB1可能也是诱导EPCs迁移的重要分子之一。晚期糖基化终产物受体(RAGE)是一种免疫球蛋白,是HMGB1天然的受体,HMGB1与RAGE结合后可活化信号通路中的多种信号转导分子。目前认为参与EPCs迁移的信号通路与MAPK、PI3K、JAK2-STAT以及转录因子NF-κB等有关。细胞骨架是参与介导细胞变形、细胞运动及细胞迁移等重要活动的蛋白质体系。PI3K/Akt信号通路在VEGF或者降血脂药物如西伐他汀诱导的EPCs定向迁移中起重要角色,并可增加EPCs内NO的合成。因此,我们设想HMGB1在作为趋化因子诱导EPCs迁移过程中可能涉及胞内PI3K/Akt/e NOS信号通路,通过影响细胞骨架结构的改变进而参与EPCs的细胞迁移活动,HMGB1可能在诱导EPCs向创面迁移,增加创面肉芽组织新生血管形成,促进创面愈合过程中起着重要作用。本研究拟重点研究HMGB1对EPCs的生物活性和功能的影响以及HMGB-RAGE轴激活PI3K/Akt/e NOS信号通路对EPCs迁移的影响;揭示HMGB1促进EPCs迁移的可能机制,明确提出创面炎症反应释放的HMGB1是趋化EPCs向创面局部迁移的重要分子之一,深化对创面修复血管形成过程中EPCs调控机制的认识,为创面治疗提供新的着力点和理论支持。研究方法:第一部分小鼠皮肤创面HMGB1的表达变化及其对创面愈合的影响建立小鼠皮肤创面模型,利用Western blot和q RT-PCR检测HMGB1在STZ诱导糖尿病小鼠及正常小鼠创面组织中的表达变化。使用HMGB1高表达腺病毒载体处理糖尿病小鼠创面,观察其对糖尿病小鼠创面愈合的影响,同时用HE、Masson、HIC染色观察创面肉芽组织厚度,新生血管数量以及胶原形成情况。使用Flow cytometry技术检测正常小鼠及高血糖小鼠外周血中CD34+细胞数量的差异性。明确HMGB1在创面愈合中的作用。第二部分HMGB1对体外培养的EPC细胞生物学特性的影响及趋化作用利用梯度离心法分离小鼠骨髓内皮祖细胞并用细胞流式方法和细胞荧光鉴定。利用Western blot和q RT-PCR实验以及免疫荧光检测检测EPCs表面HMGB1受体RAGE的表达;利用CCK-8和ELISA实验检测HMGB1对EPCs分化增殖及旁分泌作用的影响。内皮细胞小管形成实验检测其体外血管形成能力;通过体外划痕实验和细胞迁移实验检测不同浓度的HMGB1对EPCs迁移诱导作用,明确HMGB1对EPCs生物学特性及迁移的趋化作用。第三部分HMGB1诱导EPC迁移的分子机制研究通过体外划痕实验和细胞迁移实验检测并观察不同信号通路抑制剂(LY294002,PI3K抑制剂;PD98059,ERK抑制剂;L-NAME,e NOS抑制剂)以及RAGE中和抗体对HMGB1诱导EPCs迁移的影响,Western blot检测PI3K、Akt、ERK、P38,JNK蛋白的表达变化及其磷酸化过程;EPC中F-actin荧光染色后激光共聚焦显微镜观察细胞形态及细胞骨架结构变化。明确PI3K/Akt/e NOS信号通路在HMGB1诱导EPCs迁移中的作用,进一步揭示HMGB1诱导EPCs迁移的分子机制。研究结果:第一部分1.正常小鼠创面组织中HMGB1蛋白在创面形成的第1天明显升高,第3天达到高峰,而后逐渐回落。在DM组中,HMGB1蛋白在创面中的表达量明显低于血糖正常小鼠。2.糖尿病小鼠创面愈合时间较血糖正常小鼠时间明显延长。与此同时其外周血中CD34+细胞的数量明显低于正常小鼠。3.糖尿病小鼠创面使用外源性HMGB1治疗之后,创面愈合时间较对照组明显缩短。同时在创面肉芽组织形成、新生血管形成数量及胶原纤维形成等方面均优于对照组。第二部分1.流式细胞检测结果显示贴壁细胞表达CD133(49.6%)、CD34(90.03%)和VEGFR-2(76.48%)。同时表达Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1的阳性细胞数达95%以上。2.HMGB1上调EPCs中RAGE蛋白的表达,并具有浓度依赖性。3.在一定浓度的范围内(1-50ng/m L)HMGB1能够促进EPCs增殖活力,而使用Anti-RAGE-Ab后这一作用明显减弱。4.在一定的浓度范围内,HMGB1增强了EPCs分泌SDF-1的能力,同时促进EPCs的血管形成能力。5.HMGB1促使EPCs发生迁移且具有浓度依赖性。第三部分1.HMGB1增加EPCs的运动迁移。Anti-RAGE抗体显著抑制HMGB1诱导的EPCs运动。同时LY294002(PI3K抑制剂)预处理的HMGB1诱导的EPCs迁移运动被阻断,L-NAME(ENOS抑制剂)预处理的EPCs,其迁移运动也被明显减弱。但PD98059(ERK抑制剂)对HMGB1诱导的细胞运动没有影响。2.HMGB1(100ng/m L)上调了p-Akt的表达,LY294002和Anti-RAGE抗体的加入则明显抑制了这一结果。PD98059和Anti-RAGE抗体的加入,使p-ERK的表达下调,说明HMGB1-RAGE同样参与了ERK信号通路的磷酸化过程。3.HMGB1使EPCs中p-e NOS蛋白表达上调,而加入Anti-RAGE抗体、L-NAME则明显抑制了这一过程4.HMGB1处理的EPCs中NO的产量增加,而加入Anti-RAGE抗体、L-NAME(1m M)之后,NO的含量则明显减少。5.HMGB1参与了ERK信号通路的磷酸化过程,具有浓度和时间的依赖。在实验中发现HMGB1激活ERK信号通路对EPCs的细胞迁移作用并不明显。说明虽然HMGB1参与了ERK的磷酸化过程,但是其作用并没有表现在细胞迁移中,其发挥的具体作用需要进一步研究来证实。6.HMGB1激活PI3K/Akt信号通路调节EPCs中的F-actin水平。但这一过程被LY294002和Anti-RAGE抗体所阻断。结论:1.正常小鼠创面中HMGB1蛋白的表达和CD34+细胞的数量要高于糖尿病小鼠。外源性HMGB1能够促进了糖尿病小鼠创面的愈合,增加上皮化速度和新生血管密度,同时增加糖尿病小鼠循环中CD34+细胞的数量。2.外源性HMGB1上调了EPCs中RAGE的表达,并具有浓度依赖性。HMGB1在一定浓度范围内促进了EPCs的增殖和旁分泌功能。同时有助于体外血管形成能力和细胞迁移活动。同时这些功能与RAGE呈正相关。3.HMGB1-RAGE信号级联的激活引起PI3K/Akt/e NOS信号通路激活,诱导NO的产生,引起细胞骨架发生形变,导致EPCs迁移事件的发生。说明PI3K/Akt信号通路与血管内皮细胞迁移及新生血管生成存在着密切的关系。RAGE可能是HMGB1诱导的EPCs通过PI3K/Akt信号通路迁移更为有效的受体。这些结果有助于阐明HMGB1诱导EPCs迁移的分子机制,揭示HGMB-RAGE依赖的PI3K/Akt/e NOS通路是影响创面愈合的潜在治疗靶点。4.尽管HMGB1参与了ERK、JNK、P38的磷酸化过程,但MEK/ERK信号通路对HMGB1诱导的EPCs迁移没有明显的影响。因此参与HMGB1-RAGE介导的细胞迁移的信号途径可能取决于细胞类型,MAPK/ERK也可能通过其他的方法参与血管形成行为。这些潜在的机制需要在进一步的实验中确认。