背景和目的：青藤碱（sinomenine, SN）是传统中药青风藤的主要药性成分之一，其药理作用广泛；具有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛和抗心律失常等作用。青藤碱抑制细胞和体液免疫、清除活性自由基、改善血管循环、抑制巨噬细胞活化、调节细胞因子的分泌；对众多免疫活性细胞亦有作用，并且对类风湿和免疫主要相关疾病具有一定的治疗作用。研究证实，炎症性肠病（inflammatory boweldisease, IBD）具有与免疫类疾病相似的淋巴细胞介导的免疫异常的致病过程，IBD的病因和发病机制目前尚不清楚，已确认Toll样受体（toll like receptor,TLR）信号通路过度激活导致异常的免疫炎症反应从中起重要作用，然而在IBD的发病过程中青藤碱是否可以起到抑制肠道黏膜TLR信号通路过度激活来减轻炎症反应，此方面研究甚少。为此，本研究将青藤碱用壳聚糖微球作为释药载体让其在结肠部位定向释放用于治疗葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium,DSS）诱导的小鼠实验性结肠炎模型，以及检测在这一过程中TLRs信号通路中TLR4、MyD88、NF-κB p65及负性调控因子SIGIRR的表达，从而观察青藤碱治疗结肠炎模型的疗效，探讨其对IBD可能的抗炎机制。方法：1．青藤碱壳聚糖微球的制备及体外释放特性研究采用醛交联法制备青藤碱壳聚糖微球，利用正交试验并根据壳聚糖浓度、交联剂剂量、油水相体积比、搅拌速度来进行优化壳聚糖微球制备条件；使用扫描电镜及光学显微镜观察壳聚糖微球的形态及粒径分布；采用紫外分光光度法测量分析微球的包裹率、载药量及释放率，将微球包裹不同比例的丙烯酸树脂，测定其在不同溶液介质中的释放度，以评价其缓释和靶向性。2.青藤碱聚糖微球对小鼠实验性结肠炎的治疗作用及其机制的研究（1）实验分组：①正常对照组(Normal control group,N)：未建模小鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠盐溶液；②DSS模型组(Model group,M)：建模小鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠盐溶液；③柳氮磺吡啶组（Salicylazosulfapyridine,SASP）：建模小鼠给予100mg/kgSASP羧甲基纤维素钠盐溶液；④空壳聚糖微球组(Chitosan microspheregroup,C)：建模小鼠给予540mg/kg空壳聚糖微球的羧甲基纤维素钠盐溶液；⑤盐酸青藤碱低剂量组（Low dose sinomenine group,LSN）：建模小鼠给予30mg/kg盐酸青藤碱的羧甲基纤维素钠盐溶液；⑥盐酸青藤碱中剂量组（Middle dosesinomenine group,MSN）：建模小鼠给予90mg/kg盐酸青藤碱的羧甲基纤维素钠盐溶液；⑦盐酸青藤碱高剂量组（High dose sinomenine group,HSN）：建模小鼠给予270mg/kg盐酸青藤碱的羧甲基纤维素钠盐溶液；⑧青藤碱微球低剂量组（Low dose sinomenine microsphere group,LSNM）：建模小鼠给予180mg/kg（含青藤碱30mg）微球的羧甲基纤维素钠盐溶液；⑨青藤碱微球中剂量组（Middledose sinomenine microsphere group,MSNM）：建模小鼠给予540mg/kg(含青藤碱90mg)微球的羧甲基纤维素钠盐溶液；⑩青藤碱微球高剂量组（High dosesinomenine microsphere group,HSNM）：建模小鼠给予1.6g/kg(含青藤碱270mg)微球的羧甲基纤维素钠盐溶液。以羧甲基纤维素钠为药物赋形剂助悬，以上各组均以0.5%的羧甲基纤维素钠盐溶液为溶媒，青藤碱微球组以载药量同等于青藤碱组给药；每组6只小鼠，每次每天0.2ml灌胃。（2）DSS诱导小鼠结肠炎模型的建立和药物治疗：BALB/c小鼠自由饮用5％DSS溶液7天，然后停止饮用DSS改为清洁饮用水至第10天，建立小鼠急性结肠炎模型。将正常对照组只饮用清洁饮水并仅给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃作为对照组。在造模第2天开始，分别按上述分组的药物剂量给药，每天1次，直至第10天实验结束。处死小鼠，取标本待测。（3）各项指标的观察和检测：①观察每天各组小鼠体重、疾病活动指数DAI；②肉眼观察小鼠结肠大体形态改变，HE染色观察病理组织学改变；③RT-PCR方法检测小鼠结肠组织中TLR4、MyD88、SIGIRR mRNA的表达；④Western blot法检测小鼠结肠组织中TLR4、MyD88、SIGIRR蛋白的表达；⑤免疫组织化学染色检测小鼠结肠组织中MyD88和NF-κBp65蛋白的表达。结果：1.青藤碱壳聚糖微球的制备及体外释放特性研究根据影响青藤碱壳聚糖微球制备因素，采用正交设计优化条件的筛选，得出壳聚糖浓度15mg/ml,水相：油相体积比1:10，交联剂3ml，搅拌速度600rpm，温度40℃，搅拌4h制备的微球通过显微镜观察10μm-60μm的微球占总数的33.58%。扫描电镜观察结果显示成球性好，形态圆整，粘连少。测得平均粒径15.61±7.50μm，平均载药量为19.10±4.51%，平均包封率为59.00±13.26%，在经丙烯酸树脂Ⅱ、Ⅲ包裹后平均粒径达到20.72±8.03μm，包封率为67.67±1.20%。微球在PH动态药物释放中前3h人工胃液（PH1.2）和胃肠混合液（PH4.5）不释药；在人工肠液（PH6.8）2h释药小于7%，在人工大肠液（PH7.4）24h释药接近60%，而在含大鼠结肠内容物中24h释药可达70%。按此优化处方及工艺制备的用丙烯酸树脂包衣的青藤碱壳聚糖微球具有良好的形态和包封率，并且符合结肠定向释药的要求。2.青藤碱壳聚糖微球对小鼠实验性结肠炎的治疗作用及其机制的研究（1）小鼠结肠长度、体重及DAI积分变化①对照组小鼠结肠结肠全长为9.88±0.50cm。模型组和空壳聚糖微球组长度缩短至7.15±1.38cm和7.18±0.45cm，较对照组有明显缩短（P＜0.05）。除低剂量青藤碱组结肠长度为7.48±0.89cm，与模型组无明显差异（P＞0.05）。其余各治疗组为SASP组长度为8.67±0.75cm，中、高剂量青藤碱为8.83±1.00cm、9.30±0.56cm，低、中、高剂量青藤碱微球组分别为9.51±0.66cm、9.73±0.83cm、9.75±1.28cm，较模型组有显著差异（P＜0.05）。除对照组外各组小鼠在造模后体重开始下降，实验第4天体重下降至最低点，同时治疗后逐渐开始回升。在实验第5-10天治疗组体重明显回升，但模型组与空壳聚糖组小鼠体重不断减轻，与各用药物组体重下降百分比均有显著差异(P<0.001，0.05)。在实验各天数中SASP组、青藤碱组和青藤碱微球组均较对照组体重有所下降但无统计学意义(P>0.05)，各治疗组间也无统计学差异（P>0.05）。②各组小鼠DAI积分在实验第5、10天有显著差异，对照组的DAI积分显著低于模型组和各药物组(P<0.001)；实验第5天（按对照组、模型组、SASP组、空壳聚糖组、青藤碱低中高剂量组、青藤碱微球低中高剂量组顺序）DAI评分：0、8.67±1.51、3.17±0.41、9.17±0.41、1.50±0.55、0.83±1.17、0.67±1.21、1.17±1.17、0.17±0.41、0.50±0.41，各用药组积分要显著低于模型组与空壳聚糖组（P<0.001）,青藤碱中、高剂量组与青藤碱微球低、中、高剂量组间比较无统计学差异(P>0.05)。实验进行到第10天各用药组显著低于模型组和空壳聚糖组（P<0.001），用药各组其DAI均有不同程度的降低且呈时间依赖型，组间无统计学意义(P>0.05)。（2）小鼠结肠病理学改变①小鼠肠黏膜大体形态：正常对照组小鼠结肠黏膜未见充血、水肿、糜烂和溃疡，模型组和空壳聚糖组可见结肠黏膜明显充血、水肿、胀气、溃疡和糜烂。SASP组、青藤碱中、高剂量组和青藤碱微球低、中、高组结肠黏膜充血、水肿较模型组及空壳聚糖组明显改善；各治疗组结肠肉眼观察均未见明显糜烂和溃疡。②小鼠结肠病理组织学严重度评分：不同剂量青藤碱组小鼠结肠病理组织学评分中无论是结肠炎症程度、病变深度及隐窝破坏，各组间评分有显著差异（F=35.69, P<0.001；F=27.98, P<0.001；F=10.79, P<0.001），两两组间比较正常对照组均显著低于模型组及各药物组(P<0.001，0.005，0.05)；SASP组和青藤碱中、高剂量组显著低于模型组和青藤碱低剂量组（P<0.01，0.05）且组间无明显差异。同一剂型不同剂量青藤碱微球组小鼠结肠病理组织学评分中各组间有显著差异（F=74.57, P<0.001；F=72.81, P<0.001；F=54.29, P<0.001），两两组间比较显示模型组和空壳聚糖组要显著高于对照组和青藤碱微球各组（P<0.001，0.05），SASP组与青藤碱微球中、高剂量组无统计学差异（P＞0.05）。青藤碱与青藤碱微球同等剂量组小鼠结肠病理组织学评分中，青藤碱组要显著高于青藤碱微球对应的同等剂量组(P<0.001，0.005，0.05)。（3）小鼠结肠组织中TLR4表达①TLR4mRNA的表达在不同剂量青藤碱组间有显著差异（F=100.40,P<0.001），进行两两组间比较发现：模型组显著高于对照组和各用药组（P<0.01），青藤碱低、中、高剂量组，呈剂量依赖性下降，除青藤碱低剂量组外，青藤碱中、高剂量组与SASP组无显著差异（P＞0.05）。同一剂型不同剂量青藤碱微球组间有显著差异（F=157.50, P<0.001），进行两两组间比较发现：模型组与空壳聚糖组显著高于对照组与青藤碱微球各剂量组（P<0.01）。SASP组显著高于青藤碱微球中、高剂量组（P<0.01），且青藤碱微球剂量组间呈剂量依赖性降低。青藤碱各剂量组显著高于同等青藤碱微球组（P<0.01），②TLR4蛋白的表达在不同剂量青藤碱各组间有显著差异（F=64.13,P<0.001），两两组间比较发现：模型组显著高于对照组和各用药组（P<0.01），青藤碱低、中、高剂量组要显著高于SASP组（P＜0.01），呈剂量依赖性下降，且低剂量组显著高于高剂量组（P＜0.01）。同一剂型不同剂量青藤碱微球各组间有显著差异（F=118,38, P<0.001），两两组间比较模型组与空壳聚糖组显著高于对照组与青藤碱微球各剂量组（P<0.01）。SASP组显著低于青藤碱微球低剂量组（P<0.01），且与微球中、高剂量组无显著差异（P＞0.05），青藤碱微球剂量组间呈剂量依赖性降低。青藤碱各剂量组显著高于同等青藤碱微球组（P<0.01）（4）小鼠结肠组织中MyD88表达①MyD88mRNA的表达在不同剂量青藤碱各组间有显著差异（F=18.26,P<0.001），两两组间比较模型组要显著高于对照组（P<0.01），且与青藤碱低剂量组无显著差异。SASP组与青藤碱高剂量组无显著差异（P＞0.05），青藤碱剂量组间呈剂量依赖性下降。同一剂型不同剂量青藤碱微球各组间有显著差异（F=29.02, P<0.001），组间两两比较显示模型组与空壳聚糖组要显著高于对照组与各治疗组（P<0.01），SASP组与青藤碱微球各剂量组间无明显差异（P＞0.05），且青藤碱微球剂量组间呈剂量依赖性下降。青藤碱与等同剂量的青藤碱微球低、中剂量组间有显著差异（P<0.05），青藤碱高剂量组高于青藤碱微球高剂量组，但无统计学差异（t=1.06，P=0.313）。②MyD88蛋白的表达在不同剂量青藤碱各组间有显著差异（F=19.33,P<0.001），两两组间比较模型组要显著高于对照组和各治疗组（P<0.01）。SASP组与青藤碱中、高剂量组无显著差异（P＞0.05），青藤碱各剂量组间呈剂量依赖性下降。同一剂型不同剂量青藤碱微球各组间有显著差异（F=17.21, P<0.001），在两两组间比较显示模型组与空壳聚糖组要显著高于对照组与各治疗组（P<0.01），SASP组与青藤碱微球各剂量组间无明显差异（P＞0.05），且青藤碱微球剂量组间呈剂量依赖性下降。青藤碱各剂量组显著高于同等剂量的青藤碱微球组（P<0.05）.③小鼠结肠黏膜炎性细胞MyD88蛋白的表达积分在不同剂量青藤碱各组间有显著差异（H=22.642, P<0.001）,两两组间比较模型组要显著高于对照组和各治疗组（P<0.01）。SASP组与青藤碱中、高剂量组无显著差异（P＞0.05）。同一剂型不同剂量青藤碱微球各组间有显著差异（H=28.606, P<0.001），两两组间比较模型组与空壳聚糖组要显著高于对照组与各治疗组（P<0.01），SASP组与青藤碱微球各剂量组间无明显差异（P＞0.05），且青藤碱微球剂量组间呈剂量依赖性下降。青藤碱各剂量组要高于同等青藤碱微球组，但无统计学意义（P＞0.05）。（5）小鼠结肠组织中SIGIRR表达①SIGIRR mRNA的表达在不同剂量青藤碱各组间有显著（F=34.20,P<0.001），两两组间比较中模型组显著低于对照组和各用药组（P<0.01），SASP组与青藤碱各剂量组间无显著性差异（P＞0.05）。在同一剂型不同剂量青藤碱微球各组间有显著差异（F=45.53, P<0.001），两两组间比较模型组与空壳聚糖组显著低于对照组与各治疗组（P<0.01），SASP组与青藤碱微球各剂量组间无显著差异（P＞0.05），且呈剂量依赖性上升。青藤碱与同等剂量的青藤碱微球低、中剂量组间无统计学意义(t=-2.07,P=0.066；t=0.24，P=0.817)，青藤碱微球高剂量组要显著高于青藤碱高剂量组（t=-4.34,P=0.001）。②SIGIRR蛋白的表达在不同剂量青藤碱各组间有显著差异（F=22.30,P<0.001），两两组间比较模型组显著低于对照组和各用药组（P<0.01），SASP组显著高于青藤碱低剂量（P<0.01），且与中、高组间无显著性差异（P＞0.05），青藤碱剂量组间呈剂量依赖性升高。在同一剂型不同剂量青藤碱微球各组间有显著差异（F=16.98, P<0.001），两两组间比较显示模型组与空壳聚糖组要显著低于对照组与各治疗组（P<0.01），SASP组与青藤碱微球各剂量组间无显著差异（P＞0.05）。青藤碱低剂量要显著低于等同剂量的青藤碱微球低剂量组（t=-2.07，P=0.020），青藤碱中、高剂量组要高于同等剂量青藤碱微球组，但组间无统计学意义（t=-0.91，P=0.386；t=0.64，P=0.536）。（6）小鼠结肠黏膜NF-κBp65表达在不同剂量青藤碱组小鼠结肠黏膜炎性细胞NF-κB p65蛋白的表达积分在各组间有显著差异（H=31.016, P<0.001）,模型组要显著高于对照组和各治疗组（P<0.01）。SASP组与青藤碱高剂量组无显著差异（P＞0.05），显著低于青藤碱低、中剂量组（P<0.01），青藤碱剂量组间呈剂量依赖性下降。在同一剂型不同剂量青藤碱微球各组间有显著差异（H=35.351, P<0.001）,模型组与空壳聚糖组要显著高于对照组与各治疗组（P<0.01），SASP组与青藤碱微球各剂量组间无明显差异（P＞0.05），且青藤碱微球剂量组间呈剂量依赖性下降。青藤碱各剂量组显著高于同等剂量青藤碱微球组（P<0.05）。结论：1.本研究以正交优化实验筛选的青藤碱壳聚糖微球制备条件所制备的壳聚糖微球其粒径分布、包封率、载药量和释放度符合结肠定向释放制剂的要求。2. DSS诱导的小鼠实验性结肠炎肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65表达增加，而SIGIRR的表达降低。提示TLRs/NF-κB信号通路过度活化和它的负性调控机制的减弱参与了IBD的致病。3.青藤碱和青藤碱壳聚糖微球可减轻实验性结肠炎小鼠的症状、炎症和病理损伤，结肠组织中TLR4、MyD88和NF-κBp65的表达显著下降，而SIGIRR的表达有剂量依赖性上调，提示青藤碱可能通过抑制TLRs/NF-κB的激活和对SIGIRR的负性调控减轻结肠组织炎症反应。4.同等剂量的青藤碱微球组在对小鼠实验性结肠炎症状和对TLR信号通路影响方面要优于青藤碱组，提示通过载药微球可降低给药剂量，提高药物在结肠治疗浓度，有一定的缓释和靶向的作用，可有望成为中药治疗IBD的新途径。