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肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一，肿瘤的侵袭转移是肿瘤患者死亡的主要原因。目前中国恶性肿瘤发病率和死亡率呈上升趋势，肿瘤传统的治疗方法包括手术、放射治疗、化疗和生物治疗。过继性细胞免疫治疗作为生物治疗的一种方式具有广阔的应用前景。随着对肿瘤免疫机制认识的突破，近年肿瘤免疫治疗取得了令人瞩目的进展。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰T细胞的过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapies，ACIs)是目前抗肿瘤研究的热点。嵌合抗原受体主要由四部分组成，包括细胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和细胞内信号传导区。CAR修饰的T淋巴细胞(CAR-T)对肿瘤的杀伤不依赖主要组织相容性复合体(MHC)，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态，因此CAR-T细胞在治疗肿瘤方面具有独特的优势。目前研究最多的是以CD19分子为靶点的嵌合抗原受体，已经证实它在治疗B细胞白血病中显示出良好的抗肿瘤效果。 人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor2,Her-2/neu)是由c-erbB2(her2/neu)基因编码的具有受体酪氨酸激酶(RTK)活性的跨膜糖蛋白。ErbB2属于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族，ErbB2没有天然配体，单体状态下无活性，当形成二聚体时可使酪氨酸激酶活化，激活下游MAPK和PI3K/Akt信号通路，最终导致肿瘤细胞增殖。研究表明，在20％～30％的原发性乳腺癌患者中存在ErbB2/neu基因的扩增和蛋白的过度表达。在其他许多恶性肿瘤，如乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞性肺癌等也会过度表达，而在正常的组织中不表达或者微量表达。ErbB2高表达的肿瘤侵袭性强，容易发生转移，对常规的化疗和内分泌治疗反应差。临床上针对该受体的单克隆抗体药Herceptin已广泛应用。显示了较好的疗效。 中国科学技术大学刘兢教授实验室采用表面表位包埋法(SEM)获得了特异识别P185/Her2的单克隆抗体mA21，它的识别位点在ErbB2胞外区第Ⅰ亚区的C末端和第Ⅱ亚区的N末端之间，此抗体能够抑制Her2高表达的肿瘤细胞的增殖。该抗体针对的蛋白位点与目前临床使用的Trastuzumab和Pertuzumab识别表位完全不同。通过对单克隆抗体mA21进行基因操作构建了许多人源化抗体。本研究用来进行CAR-T研究的H1-2scFv、E9scFv由刘兢教授赠予。 本课题中以HER2作为肿瘤靶点，以靶向HER2的人源化单克隆抗体H1-2scFv、E9scFv为基础构建含Hinge-TM-CD28-CD137-CD3ζ的第三代嵌合抗原受体(CAR)，并探讨嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞(CAR-T)对HER2高表达肿瘤的杀伤作用。运用分子克隆方法将CAR的表达框和H1-2scFv或E9scFv装入慢病毒表达载体，利用慢病毒载体将嵌合抗原受体H1-2CAR基因转导至T淋巴细胞构建CAR-T细胞，通过酶联免疫吸附实验检测细胞因子IL-2、IFN-γ的表达，通过LDH释放实验检测CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的效率。最后用NOD/SCID小鼠移植瘤模型来检测CAR-T细胞在体内杀伤肿瘤细胞的能力。成功构建了靶向HER2的第三代嵌合抗原受体H1-2CAR、E9CAR表达载体，测序证明与设计相同。该载体转染的H1-2CAR-T细胞能与HER2+的肿瘤细胞结合并提高了细胞因子IL-2、IFN-γ的释放。在本试验中H1-2CAR-T细胞与HER2高表达的肿瘤细胞SK-BR-3相互作用时IFN-γ分泌量为6604.45±665.04pg/ml，同时IL-2的分泌量也可达到1030.01±73.09pg/ml。PBMC与肿瘤细胞相互作用时IFN-γ的分泌量在88.69±9.50～256.43±13.54pg/ml之间，而PBMC与肿瘤细胞相互作用时基本上不分泌IL-2。在体外肿瘤细胞培养体系中，H1-2CAR-T细胞对HER2高表达肿瘤细胞的杀伤率明显高于HER2低/不表达的细胞。当效靶比(E/T)为20∶1时，H1-2CAR-T细胞对HER2高表达的乳腺癌细胞SK-BR-3的杀伤率可以达到(90.07±2.75)％，而H1-2CAR-T对HER2阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-231的杀伤率只有(13.52±4.65)％。在NOD/SCID小鼠体内，CAR-T细胞治疗组乳腺癌移植瘤的生长速度减慢，实验结束时H1-2CAR-T细胞治疗组肿瘤重量平均为0.74±0.08g，NTT治疗组为1.21±0.21g，PBS组为1.22±0.23g。H1-2CAR-T治疗组的抑瘤率为38.8％，说明H1-2CAR-T具有良好的治疗作用。总之，本课题研究结果表明靶向HER2的H1-2CAR-T细胞能特异性杀伤HER2高表达的肿瘤细胞，为嵌合抗原受体修饰T淋巴细胞靶向治疗HER2+肿瘤的临床应用奠定了基础。