CCDC152 (Coiled-coil Domain Containing Protein 152)属于含有卷曲螺旋(Coiled-coil)结构域的蛋白家族。经Phyre2 3-D结构预测CCDC152的结构与酵母中的GCN4高度相似,即都含有卷曲螺旋结构域。经PSI-blast序列比对显示CCDC152可能具有甲基转移酶的生物学功能。CCDC152在高等哺乳动物黑猩猩,牛,狗,大鼠,小鼠以及鸡,斑马鱼等生物中高度保守,但功能未知。卷曲螺旋结构域能够参与细胞内重要的生物学功能,其中大部分通常作为转录因子来调节其他基因的表达。GCN4是AP-1转录因子家族的同系物,在酵母中以转录激活因子的形式存在。GCN4是一种真核生物蛋白含有亮氨酸拉链式(bZIP)结构,通过该结构与DNA相应的序列相结合。通常情况下,酵母中的GCN4能够识别并结合DNA特异性序列是有条件的：即必须形成二聚体的形式,这也是其行使功能的前提。GCN4通常形成一个包含连续α螺旋的二聚体结构靶向结合于DNA上,其所结合的DNA序列是ATG ACT CAT,这是多种氨基酸合成酶启动子上的共同保守序列。在酵母细胞中已经进化出复杂的机制来调节细胞微环境的营养水平,以应对外源性营养物质的缺乏。当酵母细胞面临某种氨基酸缺乏时,细胞内游离的tRNA增多,磷酸化转录因子GCN2,从而通过磷酸化eIF2a最终使转录因子GCN4磷酸化。磷酸化的GCN4一方面作为转录因子通过结合上述氨基酸生物合成的启动子区域,上调GAAC(General Amino Acid Control)途径从而促进所有氨基酸合成酶的合成；另一方面,通过自噬降解细胞内错误折叠的蛋白质以及破损的细胞器来提供细胞存活的能量,在这个自噬的过程中p62自噬相关蛋白的表达是下降的。目前普遍认为哺乳动物中的ATF4是酵母中同源的GCN4,即都是能应对氨基酸饥饿的转录因子。自噬的发生是一系列复杂过程的总和,主要是细胞应对外界环境应激以及细胞内病变的细胞器时,细胞内破损细胞器和错误折叠蛋白降解的存活机制,其中涉及到多种自噬相关基因的表达变化。自噬的发生过程以形成双层囊膜结构为起始,此时白噬标志蛋白LC3B由浆型的LC3B Ⅰ向膜型的LC3B ⅡⅡ转变,半包围的膜囊中包裹着细胞内需要被降解掉的细胞器以及蛋白质等,之后其外层膜与溶酶体的膜结合形成自噬溶酶体,复合体内所包含的待降解物会被溶酶体内的水解酶降解成为相应的小分子物质以供给细胞循环利用。G蛋白偶联受体(GPCR)信号系统与自噬的关系较密切,研究表明营养能够通过影响激素和神经递质的分泌来调节G蛋白偶联受体,从而系统地调节自噬的过程,此外G蛋白偶联受体还能通过直接感受细胞外的营养变化来引起自噬。本课题首先以生物信息学获取的线索为指导,结合GCN4的功能特征,探索了CCDC152的功能与自噬的关系以及CCDC152参与组蛋白修饰的检测；结合转录组测序获得的信息,探索了CCDC152与GPCR信号系统的关系。根据本课题中转录组测序结果的分析以及实验验证,CCDC152可能通过“书写不同的组蛋白密码”决定其所引起的细胞内相关生命活动的根本原因。本课题较系统地研究哺乳动物CCDC152的生物学功能及其调控机制,主要的研究方法和结果如下：实验方法：1.CCDC152是GCN4样转录因子的证明：(1)研究CCDC152在不同细胞中的定位：将红色荧光融合表达蛋白CCDC152-Red转染进Hela、HepG2、HT22、293T、MCF-7、Caco-2六种细胞,观察其在不同细胞中的定位。将绿色荧光融合表达蛋白CCDC152-GFP和CCDC152-Red共转染293T细胞,观察其在细胞中是否共定位；(2)研究过表达CCDC152后对自身启动子的影响：采用荧光素酶报告基因检测法检测过表达CCDC152对自身启动子的影响。将CCDC152-ORF和对照载体N3-pEGFP分别与连在CCDC152启动子区下游的荧光素酶报告基因PGL2-CCDC152共转染进293T细胞,测定荧光素酶的活性。设定不同浓度的CCDC152-ORF转染293T细胞,测定荧光素酶报告基因活性的变化。2. CCDC152在细胞微环境氨基酸缺乏时的应答：(1)氨基酸缺乏对CCDC152蛋白表达的影响。用EBSS对293T细胞饥饿处理不同时间,WB检测CCDC152蛋白的表达变化；(2)比较氨基酸缺乏时,CCDC152与ATF4两种蛋白的表达差异。用EBSS对293T细胞处理,WB检测ATF4蛋白的表达变化,并与CCDC152的表达变化进行比较；(3)WB检测氨基酸缺乏时内源性CCDC152亚细胞定位的变化。用EBSS对293T细胞处理,分别提取细胞的核蛋白和浆蛋白,WB检测CCDC152蛋白的表达变化；(4)过表达CCDC152,检测对p62蛋白表达的影响。将CCDC152-ORF及其对照载体N3-pEGFP转染293T细胞,WB检测p62蛋白的表达变化。3.CCDC152与自噬的关系研究：(1)观察过表达CCDC152后,对细胞形态的影响。将CCDC152-ORF及其对照载体N3-pEGFP转染293T细胞,观察对细胞形态的影响。用RAPA处理293T细胞,作为阳性对照组,观察细胞形态的变化；(2)WB检测自噬标志物LC3B蛋白中膜型蛋白LC3BⅡ与浆型蛋白LC3BⅠ表达的比值变化。将CCDC152-ORF及其对照载体N3-pEGFP转染293T细胞,并用CQ (Chloroquine)处理作为阳性对照组,分别检测不同处理对LC3B表达的影响；(3)过表达CCDC152后,观察细胞内自噬溶酶体的数量变化。将CCDC152-ORF及其对照载体N3-pEGFP转染293T、Panc-1以及HepG2细胞,借助倒置荧光显微镜观察并比较自噬溶酶体数量的变化并做统计。4. CCDC152引起细胞发生自噬的机制研究：(1) qPCR检测过表达CCDC152引起哪些自噬相关基因的表达。将CCDC152-ORF及其对照载体PcDNA3.1转染进293T细胞,提取mRNA并反转录成cDNA作为模板,检测与自噬相关的84个基因的表达变化；(2)WB验证CCDC152对典型自噬基因的影响。将CCDC152-ORF及其对照载体N3-pEGFP转染293T细胞,WB检测Bedin、ULK1、GABARAP、PI3K LC3A、ATG7蛋白的表达变化。5. CCDC152在细胞核内的定位研究：将CCDC152-ORF及其对照载体PcDNA3.1转染293T细胞,用免疫荧光方法检测CCDC152-Red在细胞核内与Cajal body、PML body的定位关系。6.转录组测序-深入研究CCDC152的功能：(1)在293T细胞中过表达CCDC152,以N3-pEGFP为对照,用RNA提取试剂盒提取RNA,并做转录组测序分析；(2)免疫荧光检测过表达CCDC152对VCL以及F-actin的影响；(3)WB检测过表达CCDC152后对Caspase9蛋白的表达影响；(4)试剂盒检测过表达CCDC152对组蛋白H3不同位点的修饰。实验结果：1.红色荧光融合表达蛋白CCDC152-Red在Hela、HepG2、HT22、293T、MCF-7、 Caco-2六种细胞中,均定位于细胞核内；绿色荧光融合表达蛋白CCDC152-GFP和CCDC152-Red在293T细胞核内共定位,这为证明CCDC152能够形成同源二聚体的转录因子提供了基本依据；2.荧光素酶报告基因检测结果显示,过表达CCDC152与对照相比,能明显增强荧光素酶的活性,并且随着CCDC152-ORF转染量的增多,荧光素酶的活性也是依次增强的。证明CCDC152能促进自身启动子的表达,这也是转录因子的证明乙一；3.氨基酸缺乏时CCDC152在15 min时表达最高,而目前普遍认为哺乳动物中“GCN4”,即ATF4,在氨基酸缺乏后的30 min表达最高。说明了CCDC 152是哺乳动物中应答氨基酸缺乏更为早期的反应蛋白；4.氨基酸缺乏引起内源性CCDC 152由细胞质进入细胞核内,在氨基酸缺乏6h时进入核内的现象最明显；5.在293T细胞中过表达CCDC 152,能像酵母细胞中的GCN4一样,下调p62蛋白的表达；6.过表达CCDC 152后与对照相比较,293T的细胞形态呈现出皱缩的现象,于用RAPA处理的293T阳性对照相比,细胞形态类似。初步证明过表达CCDC 152能引起细胞发生自噬；7.自噬标志物LC3B在过表达CCDC 152后,其膜型蛋白LC3BⅡ与浆型蛋白LC3BⅠ表达的比值明显高于对照组及阳性对照。说明CCDC152能引起浆型的蛋白LC3BⅠ向膜型的LC3BⅡ蛋白的转变,证明细胞已经发生自噬；8.过表达CCDC 152的293T、Panc-1、HepG2细胞,与对照相比,绿色荧光标志物-自噬溶酶体均显著增多。其中293T、Panc-1、HepG2细胞中过表达CCDC 152自噬率分别为41.6%、45.2%、56.5%,对照组大约都在为10%左右；9.qPCR检测试验中,过表达CCDC 152共检测84个自噬相关基因,过表达CCDC 152,能上调基因有29个,下调7个。上调的基因有ULK1、Beclin1、 GABARAP、ATG7、LC3A等较典型的自噬正调控基因,下调的基因包含FARP1;10.WB验证qPCR的结果显示,过表达CCDC 152后能使Beclin、ULK1、 GABARAP、PI3K、LC3A、ATG7蛋白的表达增加；11.CCDC152在细胞核内与Cajal body、PML body均存在共定位关系；12.转录组测序表明过表达CCDC152阻断了GPCR以及下游的相关信号通路；13.过表达CCDC 152明显减少了细胞内VCL的数量,并影响F-actin的形态；14.过表达CCDC 152后能引起293T细胞和HepG2细胞发生凋亡,但不会引起Panc-1细胞发生凋亡；15.过表达CCDC 152对组蛋白H3不同位点的赖氨酸甲基化修饰作用。结论：CCDC 152可能是通过对组蛋白H3的甲基化修饰,以转录因子的形式调控基因的转录,参与细胞内的相关代谢活动。