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目的：通过构建针对人Bmi-1基因的shRNA表达质粒载体pGeneClipTM-shRNA，研究抑制Bmi-1基因表达对膀胱癌5637细胞增殖、侵袭及转移的影响，探讨膀胱癌早期诊断、肿瘤分级和预后的分子标志物，及基因治疗的可行方案。方法：1.构建Bmi-1shRNA质粒：根据Promega公司siRNA设计程序及GenBank中Bmi-1mRNA（NM005180）序列，合成针对Bmi-1核心编码区506-1486bp中环指结构（shRNA1）、H-T-H-T结构（shRNA2）为靶向的核苷酸片段及一组错义序列。合成的发卡DNA退火、纯化后和线性化pGeneClipTM质粒载体连接，将连接产物转化感受态DH5α大肠杆菌；筛选重组体，PstⅠ酶切鉴定阳性重组子，提取质粒进行DNA序列分析，证实发卡DNA序列正确性，获得所需shRNA表达载体pGeneClipTM-B1、pGeneClipTM-B2、 pGeneClipTM-B-neg，并提取重组质粒DNA。2. pGeneClipTM-shRNA转染5637细胞：将冻存的膀胱癌5637细胞株复苏、培养、传代，实验分为4组：⑴未转染组（正常对照组）；⑵pGeneClipTM-B-neg组（阴性对照质粒组）；⑶pGeneClipTM-B1组（干扰Bmi-1环指结构）；⑷pGeneClipTM-B2组（干扰Bmi-1H-T-H-T结构）。将重组质粒按CodeBreakerTMsiRNA Transfection Reagent操作方法转染5637细胞。3.检测5637细胞转染后的各项参数：应用RT-PCR检测Bmi-1基因mRNA的表达，Western-Blot检测Bmi-1蛋白的表达，MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力，细胞划痕试验检测细胞迁移能力。4.统计方法：计量资料用（χ±SD）表示，各种结果的差异应用SPSS13.0软件统计分析。结果：1. pGeneClipTM-shRNA的构建符合设计要求：3个重组质粒分别是编码两条靶序列的重组质粒pGeneClipTM-B1、pGeneClipTM-B2及阴性对照质粒pGeneClipTM-B-neg，PstⅠ酶切鉴定分析，质粒B1、B2和B-neg均符合实验设计要求。2. shRNA抑制Bmi-1mRNA和蛋白的表达：将pGeneClipTM-B1、pGeneClipTM-B2以及pGeneClipTM-B-neg质粒瞬时转染5637细胞48h后，分别提取各组总RNA和蛋白质进行RT-PCR和Western-Blot检测。B1和B2组Bmi-1mRNA和蛋白的表达均明显低于B-neg组和未转染组（P＜0.05）；B-neg组和未转染组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。3. MTT法检测细胞增殖活性，B1和B2组细胞生长受到明显抑制（P＜0.05），而B-neg组与未转染组细胞生长无明显影响（P＞0.05）。4.流式细胞术检测细胞凋亡，B1和B2组细胞凋亡率分别为（19.83±0.17）%和（27.33±0.15）%，与未转染组（7.13±0.11）%和B-neg组（6.70±0.13）%相比，B1和B2组细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）。5. Transwell小室检测细胞侵袭力，于200倍光学显微镜下观察，B1、B2组细胞的穿膜细胞数为78.0±5.8，75.0±7.2；未转染组、B-neg组细胞的穿膜细胞数为153.0±4.6，158.0±6.7。B1、B2组与其他两对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。6.细胞划痕实验检测迁移能力，B1、B2组划痕48h后融合趋势仍不明显，未转染组和B-neg对照组两侧细胞大部分已接近融合。结论：1.针对Bmi-1基因环指结构和H-T-H-T结构的pGeneClipTM-shRNA均可以有效抑制Bmi-1mRNA和蛋白的表达。2. Bmi-1shRNA可以抑制膀胱癌5637细胞的增殖、侵袭及转移。