棉花幼苗盐胁迫条件下Solexa转录组测序结果的分析及验证

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盐胁迫是全世界范围内影响作物产量的最严重的非生物胁迫之一,利用基因工程提高植物的耐盐性,培育出适合在盐渍化土地上生长的植物品种是有效利用盐渍化土地的主要方法。棉花是一种生物学研究中常用的模式植物,盐胁迫会严重影响棉花的生长和产量,尤其是在种子萌发和幼苗生长阶段。棉花耐盐的生理机制已经得到广泛的研究,具体机理包括离子的平衡、渗透调节物质的积累以及抗氧化剂的积累。但是棉花耐盐的分子机理研究较少,因此,深入研究棉花盐响应机理有助于利用基因工程手段提高棉花的耐盐性。本实验通过Solexa高通量测序的方法,对盐胁迫处理前后的棉花幼苗进行转录组测序,通过分析大量的测序结果,发现了相当多受盐胁迫处理上调和下调的基因,揭示了棉花幼苗盐处理前后转录组水平的复杂的调控网络。之后,利用qRT-PCR的方法对测序结果进行了验证。并对NaCl处理后,上调非常明显的4个编码LEA蛋白的基因进行表达模式的分析、基因的分离、系统发生分析和功能验证。主要实验结果和结论如下:(1)对照和盐处理两个Solexa测序样品分别检测到3 583 646和3 694 330个具有信号的探针,各包含了395 874和389 356个特异性标签。通过排除假阳性标签,余下的清晰标签分别为145 794和138 518个。通过对照棉花基因表达的数据库网站,分别找到了75 500(51.8%)和72 077(52.0%)个匹配的标签。我们以log2值(变化倍数)>2和<-2、P-value值(统计学有效值)<0.001、FDR(错误发生率)<0.01作为筛选基因的标准,找到了223个上调基因和317个下调的基因。其中,未知基因约占45%。参与不同信号通路的基因都发生了不同程度的上调和下调,表明它们在植物适应盐胁迫的过程中发挥着重要的调节作用。(2)利用RT-PCR的方法检测了22个基因的相对表达量,结果与测序结果基本一致,表明转录组测序结果是可靠的。(3)利用qRT-PCR的方法检测了4个LEA基因和3个已知的非测序结果筛选得到的LEA基因的相对表达量,结果显示,4个LEA基因受盐胁迫诱导上调的倍数要明显高于其它3个LEA基因,表明这4个LEA基因在棉花耐受盐胁迫过程中发挥着主要作用。4个LEA基因的组织表达模式结果显示,M19406受NaCl诱导的表达量显著高于TA241663635和X15086,且三者在真叶和根中的诱导表达模式一致;但M19379在真叶中几乎检测不到它的表达,而在根中受盐诱导表达显著。(4)我们通过RACE的方法分离得到4个LEA基因的全长序列。利用ClustalX等生物学软件,对4个棉花、18个拟南芥和14个水稻的LEA蛋白基因进行系统发生分析。结果显示,不同LEA蛋白组别之间差异较大,棉花的4个LEA基因M19379、M19406、TA241663635、X15086分别从属于dehydrin、PvLEA18、LEA2、LEA4四个不同的组别。(5)在酵母中表达M19379、M19406、TA241663635、X15086四个LEA基因,分别在固体和液体YPG培养基上进行胁迫抗性分析。结果显示,M19379、M19406、TA241663635、X15086均能不同程度的提高酵母菌株对盐胁迫、渗透胁迫和氧化胁迫的抗性。初步验证了4个LEA基因在棉花对逆境的适应过程中发挥的作用,这为将4个LEA基因在拟南芥中过量表达,进一步研究其机理奠定了基础。
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