巴戟天系茜草科(Rubiaceae)巴戟属(Morinda Linn.)多年生攀援木质藤本植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根。主要分布于广东、广西、福建等省，是我国著名的“四大南药”之一。本品性微温、味甘辛，有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效。在临床中，用于治疗阳痿遗精，宫冷不孕，月经不调，风湿痹痛，筋骨痿软等。 巴戟天多糖是巴戟天补肾壮阳、强壮筋骨的重要物质基础。然而，对于巴戟天多糖的提取、分离、纯化报道较少，对均一多糖的理化性质及结构特征的研究更是缺乏。鉴于此，本文重点对巴戟天多糖成分进行系统的提取、分离、纯化研究，考察均一多糖的理化性质及结构特征，在此基础上，对巴戟天多糖抗疲劳、清除自由基活性进行了评价，旨在探讨巴戟天抗疲劳、抗氧化药效物质基础。此外，对巴戟天小分子成分进行分离和结构鉴定，对抗炎镇痛有效成分水晶兰苷(monotropein)的含量进行测定。 研究内容概述如下： 1、巴戟天多糖的制备 介绍巴戟天多糖的制备过程，在此基础上确定巴戟天多糖制备工艺路线；95％乙醇提取脱脂除寡糖，热水提取多糖，95％乙醇醇沉，Sevag试剂脱蛋白，活性碳脱色，透析袋透析除杂，DEAE—Sepharose CL—6B离子交换色谱及SephadexG—75、Sephadex G-100凝胶滤过色谱联合分离纯化，最后得到三个均一多糖，MP-1、MP—2和MP—3。 2、巴戟天多糖制备工艺的优化 采用传统的热水提取法，以多糖提取得率为指标，考察提取温度、时间、次数、液料比等工艺参数；以多糖醇沉得率为指标，考察乙醇沉淀工艺；以多糖损失率、脱蛋白率为指标，考察脱蛋白工艺；以脱色前后溶液的颜色变化以及多糖的损耗率为指标，考察脱色工艺；考察透析工艺；以硫酸—苯酚法检测多糖，考马斯亮蓝法检测蛋白质，考察DEAE—Sepharose CL—6B离子交换色谱层析及Sephadex G—75、Sephadex G-100凝胶滤过色谱层析纯化工艺。确定巴戟天多糖最佳的提取、分离、纯化工艺。巴戟天总多糖MOA的得率为23.28％(以生药量计算)，均一多糖MP-1、MP—2和MP—3的得率分别为27.32％、7.85％、20.57％(以MOA计算)。 3、巴戟天均一多糖的理化性质及结构特征研究 综合利用物理化学方法对巴戟天均一多糖MP-1、MP—2、MP—3的理化性质及结构特征进行研究，内容包括：多糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量、硫酸基含量、旋光度、元素测定、糖醛酸羧基还原、部分酸水解、高碘酸氧化—Smith降解、甲基化分析、特性粘度测定、高效凝胶渗透色谱(HPGPC)、紫外可见光吸收光谱(UV)、傅立叶变换红外光谱(FT—IR)、飞行时间质谱(TOF—MS)、纸色谱(PC)、气质联用色谱(GC—MS)、一维及二维核磁共振光谱(NMR)、原子力显微镜(AFM)等。确定MP-1、MP—2、MP—3为均一多糖，分子量分别为2165、19494、27705 Da。MP-1为菊淀粉类果聚糖，聚合度为22，即由21个呋喃型的果糖以β(2→1)糖苷键相连、1个吡喃型的葡萄糖以α(1→2)糖苷键连接在果糖末端的线性直链结构化合物。MP—2含有90.23％的总糖、30.85％糖醛酸及0.76％的蛋白质，单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸，摩尔比为1:53.67：0.63：1.01:0.51:16.05：30.02。主链由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸组成；支链主要由阿拉伯糖组成，带有少量的鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖；主要的糖基连接方式有1→2、1→4、1，2→6、1，4→6、1→、1→6(六碳糖)或者1→、1→5(五碳糖)：半乳糖醛酸主要以1→4连接方式存在于主链中，推测MP—2为果胶类多糖。MP—3亦为类似果胶多糖的酸性多糖，含有91.87％的总糖、43.34％糖醛酸、0.49％的蛋白质及2.62％的硫酸根，单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸，摩尔比为1:57.18:10.36:50.38。主链由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸组成；支链主要由阿拉伯糖组成，带有少量的鼠李糖及半乳糖；糖基的连接大多数都不能被高碘酸氧化；1→4连接的半乳糖醛酸其羟基取代占主导地位。此外，AFM及特性粘度测定实验表明MP—2及MP—3在水溶液里容易产生分子聚合现象。 4、巴戟天小分子成分的分离及水晶兰苷的含量测定 采用传统的提取分离手段：乙醇提取，正相、反相柱层析等方法，对巴戟天中的小分子化学成分进行了较系统的分离纯化，从巴戟天的乙醇提取物中分离得到7个化合物，经光谱(1H—NMR、13C—NMR、MS等)鉴定了其中6个化合物的结构，为蒽醌、甾体及环烯醚萜苷类成分。采用高效液相法(HPLC)测定巴戟天药材中水晶兰苷的含量，结果表明其含量达到1％以上。 5、巴戟天多糖小鼠抗疲劳及体外清除自由基活性评价 采用小鼠负重游泳模型，评价巴戟天多糖抗疲劳活性，考察指标为小鼠体重的变化，负重游泳时间，以及小鼠血清尿素氮、血乳酸、肝糖元三项生化指标。结果表明，巴戟天多糖剂量组小鼠体重都呈增长趋势，但与对照组比较无显著差异；能显著提高小鼠负重游泳时间；降低运动后小鼠血乳酸、血清尿素氮含量；并能增加小鼠肝糖原含量，提示有明显的抗疲劳作用，特别是中、高剂量组。采用经典的体外DPPH清除模型，评价巴戟天多糖清除自由基活性。结果巴戟天多糖具有呈剂量依赖性的DPPH自由基清除能力，其中以巴戟天总多糖MOA的效果最为明显，当浓度达到5 mg/mL以上时，其自由基清除率比阳性对照品Vc和BHT还要高。巴戟天多糖表现出抗疲劳、清除自由基的活性，提示巴戟天多糖为巴戟天抗疲劳、抗氧化的重要活性物质基础。