众所周知,ω3系的超长链多不饱和脂肪酸(very long-chain polyunsaturated fatty acids, VLCPUFAs)特别是EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5n3)和DHA(docosapentaenoic acid, 22:6n3)对人类健康非常重要。日常摄入一定量的VLCPUFAs能够补充人体自身合成的不足,对某些疾病起到明显的预防和治疗作用。VLCPUFAs的主要来源是深海鱼油,但是由于市场需求的迅速增长和海洋可捕捞鱼类资源的日益减少,该途径已经远远不能满足需要,寻找更为持续、稳定的VLCPUFAs来源已经成为当务之急。海洋微藻是海洋食物链的初级生产者,许多种类能够从头合成VLCPUFAs且含量较高。海藻以其脂肪酸组成稳定,不含胆固醇,没有难闻的鱼腥味和重金属元素污染等优点正逐渐成为鱼油的良好替代资源,具有巨大的开发潜力。近年来,对海洋微藻VLCPUFAs合成及存储相关酶基因的研究进展很快,已在多个藻种中克隆得到了参与EPA、DHA合成的去饱和酶和延伸酶基因。将该类基因在植物特别是油料作物中表达,使之作为“绿色细胞工厂”生产VLCPUFAs的研究已成为植物代谢工程研究领域的热点之一。国外多个小组进行了转基因植物合成VLCPUFAs的探索并取得了突破性的成果。国内目前还没有这方面的报道。及时开展相关研究,获得具有自主知识产权的酶基因,不仅有助于阐明微藻脂肪酸合成及存储途径,阐明脂肪酸随环境因子变化而变化的机理,也可为经济微藻的优化培养与遗传改良提供一定的分子基础,为转基因植物合成VLCPUFAs的研究提供基因来源,因此具有重要的理论意义和广阔的应用前景。本实验选择了两种海洋真核微藻-三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和微拟球藻(Nannochloropsis oculata)进行EPA合成途径中去饱和酶的研究。这两种藻均富含EPA,含量可达总脂肪酸的30%以上,说明在这两种藻中存在高效合成EPA的酶系,有望克隆得到具有较高底物特异性和酶活性的去饱和酶基因。此外,这两种藻均能够进行大规模培养,本身就可作为EPA的来源。二者在脂肪酸合成上也存在一些差异,如三角褐指藻的EPA合成途径比较复杂,推测存在4条通路,而微拟球藻的相对简单,只有经典的n6、n3途径;除EPA外,三角褐指藻还含有少量DHA,而微拟球藻不含DHA。弄清楚存在这些差异的原因有助于对这两个藻种进行比较研究。目前对这两种藻的研究程度也不尽相同,对三角褐指藻的研究较为深入,已有4个去饱和酶基因被克隆鉴定,该藻的基因组测序及注释工作也即将完成;对微拟球藻的研究较少,分子信息相当缺乏,还没有去饱和酶的研究报道。通过分析已有资料,本实验在进行这两种藻的去饱和酶基因克隆时采取了不同的研究方法。已知三角褐指藻的4条EPA合成途径均需要Δ5脂肪酸去饱和酶的作用,可见Δ5位去饱和是EPA生成的关键步骤。先前已有研究者克隆得到一个Δ5去饱和酶基因(PtD5),表达后发现能将13.3%的ETA(20:4Δ8,11,14,17)转化为EPA(20:5Δ5,8,11,14,17),而在藻细胞中这一转化效率几乎为100%。为什么会出现这种差异呢?推测藻细胞中至少还存在一个Δ5去饱和酶。通过应用简并PCR、反向PCR及RACE等方法,在三角褐指藻中成功克隆得到一个类Δ5去饱和酶基因序列(PtD5-2)。全基因序列共1561bp,在第303～432位碱基之间有一个内含子,转录后的mRNA翻译区有1431nt,可翻译为476个氨基酸残基。分析显示翻译后的蛋白序列具有“前端”去饱和酶的明显特征,如N端细胞色素b5结构域;3个极为保守的组氨酸簇(分别为HDANH、HWTHH、QVEHH),第3个组氨酸簇的第1个H被Q替代。此外,具有4个明显的跨膜α螺旋区,分别位于132～148、153～172、256～274和334～352位氨基酸残基之间。将该序列在NCBI BLAST中做Protein-Protein BLAST,结果与三角褐指藻的第1个Δ5去饱和酶(PtD5)及海链藻的Δ5去饱和酶(DesO)同源性最高(Identity分别51%和47%)。关于该酶的功能鉴定工作正在进行中。微拟球藻脂肪酸合成方面的资料较少,到目前为止还没有从该藻中克隆得到去饱和酶基因的报道,而且该藻的其它分子信息也相当缺乏。鉴于微拟球藻重要的生态及经济价值,获取更多的基因信息从而对其进行深入研究是必需的。生成表达序列标签(ESTs)是得到表达基因信息的有效途径,本实验选择了EPA含量较高的指数生长末期的藻细胞,构建了微拟球藻的cDNA文库并进行了大量的EST测序,以期在分子水平上对该藻有更为全面的了解,并试图从中获得EPA合成相关的去饱和酶基因。试验共获得5315条EST序列,长度100-716 bp,非冗余序列(non-redundant sequences, NRSs) 1960条,其中仅有32.5%的NRSs与nr库中的蛋白序列具有相似性(E<1e-04),25%的NRSs能够得到KOG注释并根据其可能的细胞功能被归于24个功能组。大多数NRSs与已知的蛋白没有明显相似性,说明该藻可能具有许多非常独特的基因。虽然指数末期的藻细胞EPA含量很高,但是在所测的ESTs中未能分析得到去饱和酶的相似序列。令人惊讶的是改用简并引物扩增ω3去饱和酶基因片段也未能得到任何条带,这一结果进一步证明了该藻遗传信息的特殊性,表明该藻的去饱和酶基因似乎也较为独特。此外,本实验应用实时定量PCR初步研究了PtD5和PtD5-2基因在三角褐指藻不同生长期的表达变化。发现两个基因的表达趋势是相同的,均在指数生长期表达水平最高,而在指数末期表达量显著下降,在静止初期最低,进入静止期后略有升高。两个基因在指数生长期的表达量是其静止初期的20倍。对不同生长期的三角褐指藻进行脂肪酸分析,发现EPA含量在整个生长期内均很丰富,一直是总脂肪酸中所占比例最高的;而4个时期相比较则指数生长期的藻细胞EPA含量最低(占总脂肪酸的29%),指数末期明显升高(占总脂肪酸的35%),而后保持稳定直至静止期。这个现象非常有趣,即去饱和酶基因表达量最高时EPA含量最低,而当基因表达水平降低后EPA含量反而有所升高。这也许反映了从基因表达到产物合成的时滞,但是具体原因还需要进一步探索。该试验结果可为微拟球藻及其它微藻的研究提供参考。如果微拟球藻去饱和酶的基因表达与三角褐指藻类似,在构建cDNA文库时就可以考虑选取指数期的藻细胞。综上所述,本研究克隆了三角褐指藻的一个类Δ5脂肪酸去饱和酶基因,序列分析表明其极有可能是该藻的第2个Δ5去饱和酶,如果能够确定其功能,那么这是在三角褐指藻中具有两个Δ5去饱和酶的首次报道,对阐明该藻复杂的EPA合成途径具有重要参考价值,也为基因的表达调控及应用研究提供了分子基础。此外,本研究首次构建了微拟球藻的cDNA文库并进行了大量的EST测序,在分子水平上探讨了微拟球藻的表达信息特征,为今后开展包括EPA合成在内的多项研究奠定了基础。