论文部分内容阅读
第一章NOTCH3基因突变的研究目的通过对临床拟诊伴皮层下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)患者进行NOTCH3基因的2-23外显子突变检测,对疾病作出基因诊断。方法采用DNA直接测序方法对25例临床拟诊CADASIL先证者进行NOTCH3基因的2-23外显子突变检测；并对已发现突变的先证者8个家系成员共116人,进行突变外显子检测；正常对照组100样本进行NOTCH3基因测序。结果①发现9例NOTCH3基因突变(35%),突变分别分别位于第3外显子的R90C,第4外显子的R133C、R153C、C185Y、R182C(2例)、R133S及第11外显子的R544C(2例),均为错义点突变。②第4外显子的R133S突变是一种新的保留半胱氨酸的NOTCH3基因突变。③1例散发患者存在位于第4外显子的R182C突变。结论①首次报道4外显子的R133S突变是一种新的保留半胱氨酸的NOTCH3基因突变。②国内首次报道1例散发患者存在第4外显子的R182C突变。第二章NOTCH3蛋白及GOM对CADASIL诊断价值的研究目的探讨KLH法制备的NOTCH3氨基端(N)多克隆抗体及GOM对CADASIL诊断价值。方法应用人工合成NOTCH3氨基端(N)一个多肽片段,通过KLH方法制备全新NOTCH3N-末端多克隆抗体,通过纯化后、经ELISA法及Western blot证实得到的抗体为抗NOTCH3N-末端的特异抗体。31例CADASIL患者及25例匹配的非CADASIL对照患者分别行皮肤活检,通过电子显微镜观察血管超微结构改变,并评估其超微结构GOM沉积,以及NOTCH3N-末端多克隆抗体的免疫组化方法的敏感性和特异性。结果①成功的制作了NOTCH3N-末端多克隆抗体。②31例患者的皮肤血管超微结构表现：大多数血管壁增厚,颗粒样嗜锇性物质主要沉积在小动脉和小静脉血管平滑肌细胞表面,偶尔位于毛细血管内皮细胞周围。血管平滑肌细胞和内皮细胞变性,它们细胞质中充满许多嗜锇性物质小泡以及线粒体空泡样变性。25例对照中仅1例老年人中偶见血管基底膜增厚。③31例CADASIL患者超微结构GOM沉积的敏感性为54.5%,特异性为96%；而用NOTCH3N-末端多克隆抗体的免疫组化方法的敏感性为75.7%,特异性为98%；将两种方法结合其敏感性为91%,特异性为97%。结论这种全新的NOTCH3N-末端特异性抗体的免疫组化方法结合电镜超微结构GOM能有效提高CADASIL确诊率。第三章NOTCH3蛋白与GOM关系的研究目的探讨NOTCH3蛋白与GOM两者之间关系。揭示GOM的生物化学特性和来源。方法应用人工合成NOTCH3氨基端(N)及NOTCH3羧端(C)两个多肽片段,通过KLH方法制备抗NOTCH3N-末端多克隆抗体和NOTCH3C-末端多克隆抗体,纯化后、经ELISA法及Western blot证实得到的两个抗体均为特异抗体。9例CADASIL患者及25例匹配的非CADASIL对照患者分别行皮肤活检,其中2例CADASIL患者行脑组织活检,而2例非CADASIL患者脑组织作为对照,利用免疫电子显微镜技术揭示GOM与NOTCH3受体外侧和内侧结构域的关系。结果①成功的制备NOTCH3N-末端多克隆抗体和NOTCH3C-末端多克隆抗体。②CADASIL患者脑组织和皮肤血管平滑肌细胞表面均有GOM和NOTCH3N-末端抗体特异的胶体金颗粒沉积,无NOTCH3C-末端抗体特异的胶体金颗粒沉积；这些NOTCH3N-末端抗体特异的胶体金颗粒沉积邻近GOM,或位于GOM内。③对照组中未发现GOM的沉积及NOTCH3抗体胶体金颗粒沉积。结论GOM的主要成分可能为NOTCH3受体外侧结构域,揭示GOM生物学特性和它与NOTCH3基因的关系,为进一步揭示CADASIL的病理机理提供新的研究思路。