研究背景：苦参碱是从我国传统中药苦参的干燥根中提取出的一种生物碱活性成分，具有广泛的药理学作用。近年来的研究表明，苦参碱能在体内、外对多种肿瘤细胞起作用，诱导肿瘤细胞凋亡。然而，苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制还不明确。目前，对祖国传统医学宝库中的传统中草药进行大力开发，采用分子生物学手段对其药理学作用给予新的诠释，致力于研究开发出新的抗癌药物，来大力弘扬祖国传统医学，已成为当前中医药研究的发展趋势。在这样的大背景下，深入探讨苦参碱的抗肿瘤作用分子机制，无疑是一项很有前景和研究价值的课题。凋亡是受精密调控的过程，许多蛋白都参与了凋亡过程的调控，其中研究较多，作用较明确的分子包括以下蛋白家族：半胱氨酸蛋白酶caspase，Bcl-2家族蛋白，凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis，IAP)家族，p53及NF-κB家族蛋白。目前关于中药单体对上述凋亡调控家族及其内部信号转导通路的系统研究还未见报道。本研究通过免疫印迹技术检测苦参碱处理的MKN45细胞中上述蛋白表达水平的改变，来阐明苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制。研究结果有助于寻找中药单体的作用靶点或信号转导通路，对进一步评价和开发中药单体有科学意义和应用价值。研究目的：明确苦参碱是否能在体外诱导胃癌MKN45细胞凋亡；研究苦参碱诱导胃癌MKN45细胞凋亡的分子作用机制；明确苦参碱是否对凋亡调控分子caspase、Bcl-2家族、p53及NF-κB蛋白表达水平产生影响；找出苦参碱诱导MKN45细胞凋亡的相关信号转导通路或靶点。研究方法：1．MTT法检测苦参碱干预后，MKN45细胞增殖抑制2．流式细胞仪检测细胞周期改变和凋亡细胞的比例3．DNA ladder电泳检测凋亡DNA4．免疫印迹法检测激活的caspase、Bcl-2家族蛋白、p53蛋白、IκB家族蛋白以及NF-κB各亚单位的蛋白表达水平。研究结果：主要研究结果如下：1．苦参碱抑制MKN45细胞增殖和诱导凋亡的研究1．1苦参碱对MKN45细胞增殖的影响MTT法检测苦参碱对MKN45细胞生长的影响。不同剂量苦参碱(0.05，0.10，0.25，0.50，1.0mg/ml)作用于MKN45细胞48小时以后，细胞的增殖抑制率分别为6.25±2.34％，9.04±1.52％，12.56±4.34％，49.91±2.78％，94.14±0.62％(P＜0.0001，bilateral ANOVA)。在浓度为0.50mg/ml时，抑制率明显上升，达49.91％。半数细胞死亡的药物浓度(IC50)为0.53mg/ml(95％CI，0.49-0.58mg/ml)。该结果提示，苦参碱在体外能以剂量依赖的方式明显地抑制MKN45细胞增殖。1．2苦参碱对MKN45细胞周期的影响上述不同剂量苦参碱处理MKN45细胞48小时以后，我们采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡细胞的变化情况。结果显示，随着苦参碱剂量的增加，S期的细胞比例减少，G2/M期的细胞有下降趋势，而对于G0/G1期变化不明显，只有在苦参碱浓度达0.50mg/ml时明显降低。在凋亡细胞比例方面，随苦参碱剂量的增加，凋亡细胞百分比增多。不同剂量下(0，0.05，0.10，0.25，0.50mg/ml)凋亡的细胞百分比分别为：1.44％，1.63％，6.22％和26.88％。以上结果提示，苦参碱在体外通过G0/G1期细胞阻滞而引起MKN45细胞凋亡，其凋亡呈剂量依赖性。1．3 DNA ladder电泳检测凋亡的DNA凋亡的细胞在DNA电泳时会出现特征性的DNA梯状条带。我们用不同剂量苦参碱处理MKN45细胞48h后，提取总DNA进行电泳。结果表明，只有苦参碱干预的细胞出现梯状条带，而对照组不显现，由此可以明确苦参碱在体外能诱导MKN45细胞凋亡。1．4苦参碱对MKN45细胞caspase激活的影响用不同剂量苦参碱处理MKN45细胞48h后，免疫印迹检测激活的caspases(cleaved caspase-3、-6、-7、-8、-9)的表达情况，结果表明，只有caspase-3和caspase-7才被激活。我们进一步检测了不同时间点(0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h)cleaved caspased-3、-7的表达情况来明确苦参碱诱导的凋亡是否是时间依赖性，结果表明，只有在药物作用48h时，caspase-3和caspase-7才被激活，说明caspase的激活是时间非依赖性的。2．苦参碱对MKN45细胞中Bcl-2家族表达影响的研究2．1苦参碱对MKN45细胞中抗凋亡Bcl-2亚家族表达影响免疫印迹检测抗凋广Bcl-2亚家族中Bcl-2，Bcl-xL蛋白在受苦参碱处理的MKN45细胞中表达的改变，结果提示，在低剂量的0.05和0.10mg/ml组(以下简称低剂量组)与未给药组相比变化不明显，而高剂量的0.25和0.50mg/ml组(以下简称高剂量组)则明显降低。2．2苦参碱对MKN45细胞中促凋亡Bcl-2亚家族表达影响在免疫印迹所检测的七个促凋亡分子(Bak，Bok，Bax，Bim，Puma，Bad，和Bik)中，蛋白表达水平与未给药组相比，除了Bad和Bik外，都显示有相同的变化趋势，即在低剂量组明显增高，而高剂量组降低，而Bad和Bik在各剂量组的变化不明显。2．3苦参碱对MKN45细胞中Bcl-2/Bad/Bax通路的影响我们进一步免疫印迹检测了药物处理后磷酸化的Bad和Bcl-2以及接头蛋白14-3-3来检测苦参碱是否对Bcl-2/Bad/Bax通路产生影响。结果表明，苦参碱处理后对磷酸化的Bad、Bcl-2和14-3-3蛋白水平改变不明显，说明苦参碱不对Bcl-2/Bad/Bax通路产生影响。2．4苦参碱对MKN45细胞中p53的影响我们进一步检测了促凋亡Bcl-2分子Bax，Puma的上游分子p53的蛋白表达水平，结果表明p53在低剂量时增高，高剂量时降低。3．苦参碱对MKN45细胞中转录因子κB及IκB家族蛋白表达影响的研究3．1苦参碱对MKN45细胞中IκB家族蛋白表达的影响3．1．1苦参碱对MKN45细胞中IκBα、IκBβ蛋白表达的影响免疫印迹法检测各组IκB家族蛋白中IκBα、IκBβ的蛋白表达水平。结果表明，与对照组相比，IκBα和IκBβ的表达除了在0.5mg/ml降低以外，在其余各组都增高。3．1．2苦参碱对MKN45细胞中IKKα、磷酸化IκBα蛋白表达的影响我们进一步检测了IκB的调节蛋白IKKα以及磷酸化的IκBα在苦参碱处理的MKN45细胞中的表达情况，结果表明，药物处理组的IKKα、磷酸化IκBα表达均高于未处理组。3．2苦参碱对MKN45细胞中NF-κB家族蛋白表达的影响3．2．1苦参碱对MKN45细胞中NF-κB亚单位在细胞核表达的影响因为NF-κB激活过程伴有各亚单位从细胞浆转位到细胞核，我们分别检测了各组细胞NF-κB三个亚单位p65(RelA)，p50/p105(NF-κB1)，和p52/p100(NF-κB2)在细胞核的表达情况，来明确哪些亚单位参与了NF-κB激活。结果表明，在细胞核蛋白中检测到了p65和磷酸化的p65以及p52/p100，而p50/p105在细胞核中未见。由此推测苦参碱可以导致p65和NF-κB2的激活。在所激活的NF-κB亚单位中，p65以及磷酸化的p65在各组表达水平存在差异，表现为与未给药组相比，低剂量组表达增高，而高剂量组表达降低。而在激活的NF-κB2中，p52(NF-κB2的激活形式)的表达明显多于其前体蛋白p100，说明NF-κB2的激活伴随p52蛋白从胞浆向胞核转位。在胞核蛋白中，p52在各组的表达水平也存在差异，与对照组相比，低剂量组表达量增高，而高剂量组降低。与之相反的是，p100在高剂量组的含量高于低剂量组，说明p100转化为活性形式p52而导致NF-κB2被激活。3．2．2苦参碱对MKN45细胞中NF-κB亚单位在细胞浆表达的影响在细胞浆蛋白中，可以检测到p105以及磷酸化的p105，而NF-κB1的激活形式p50在细胞浆中未检出，说明苦参碱不能激活NF-κB1。而且苦参碱处理的细胞中磷酸化的p105表达水平降低，进一步说明苦参碱干预后，NF-κB1的激活受到抑制。结论：1．低剂量苦参碱能增加Bcl-2家族的促凋亡分子：Bak，Bok，Bax，Bim，Puma的表达，而对促存活分子Bcl-2，Bcl-xL影响较小。苦参碱不对Bcl-2/Bad/Bax通路产生影响。2．低剂量苦参碱能增加Bax，Puma的上游分子p53蛋白表达水平。3．低剂量苦参碱能激活p53上游核转录因子κB的p65和p52亚单位。4．我们推测低剂量苦参碱诱导MKN45凋亡的信号通路为：苦参碱-＞MKN45细胞-＞p65，p52-＞p53-＞Bax，Puma-＞caspase激活-＞凋亡