论文部分内容阅读
该文在该实验室前期工作的基础上,应用PCR突变方法获得重组人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA,将其克隆于PGEM-T-Vector,进行DNA序列分析,结果正确后再将其克隆于甲基营养型酵母~毕赤酵母(Pichia Pastoris)表达载体pHIL-SI及pPIC9、pPIC9k,前者还有酸性磷酸信号肽,后二者则带有α交配因子的信号肽,转化毕赤酵母细胞GS115,在含甲醇的不同培养基中诱导表达.在此工作的基础上,通过PCR方法,获得含重组人组织型纤溶酶原激活剂全长cDNA和含尿激酶型纤溶酶原激活剂cDNA中Ku区的嵌合型纤溶酶原激活剂t-u-PA cDNA,将此嵌合t-u-PA cDNA克隆于PGEM-T-Vector,DNA限制性酶切签定后,克隆于毕赤酵母表达载体pPIC9k,转化毕赤酵母细胞,在含甲醇的培养基中诱导表达.用PCR方法获得tPA cDNA与嵌合型t-u-PA cDNA,DNA序列及限制性内切酶分析,其DNA序列正确.克隆有tPA cDNA、t-u-PA cDNA的毕赤酵母表达载体,能够稳定存在于毕赤酵母细胞中.双滤膜原位杂交系统检测发现毕赤酵母系统能够分泌表达重组人tPA、t-u-PA.t-PA、t-u-PA在毕赤酵母细胞GS115中的表达规律为:6小时即有表达,3~4表达量达高峰,可持续表达7天,用G418筛选的t-PA高表达株可持续表达28天.t-PA、t-u-PA经SDS-PAGE及Western blot证实GS115细胞表达的t-PA、t-u-PA分子量分别为67KD、80KD左右,具有糖基化.毕赤酵母系统表达的t-PA、t-u-PA用纤维平板检测活性,具有较强的纤维蛋白降解作用.蛋白检测试剂盒检测毕赤酵母系统分泌表达t-PA、t-u-PA含量分别为200mg/L、180mg/L.用t-PA和尿激酶作标准曲线,检测t-PA比活性为6.8×10<5>U/mg.t-PA SDS-PAGE电泳结果薄层扫描,表达量为52﹪.