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目的：
1.预测癌胚抗原（CEA）的CTL、B细胞表位，为CEA表位疫苗设计及其单克隆抗体制备等研究提供理论依据。
2.通过对CEA的CTL、B细胞表位预测分析，选择含多个CTL、B细胞表位的短肽（CEA580-598）基因，构建CEA580-598多表位的原核重组质粒pET32a（+）/CEA580-598，用带有6个组氨酸标签（His.tag）的PET32a（+）原核表达系统表达CEA580-598表位肽融合蛋白，并通过Ni-NTA树脂亲和层析法纯化获得表位融合蛋白，命名为ozlf-75/76。
3.将纯化的表位融合蛋白ozlf-75/76免疫日本大耳白兔，制备高效价特异性兔免疫血清抗体，为建立CEA免疫检测的方法打下了基础。
方法：
1.根据本实验室对CEA B表位预测的结果[1]，筛选CEA B表位，另通过在线软件SYFPEITHI法进行HLA-A2，HLA-A24和H2-Kd限制性的CTL表位的预测，选择含多个CTL表位肽和B表位肽的CEA580-598短肽作为目的基因。
2.按原核系统偏爱的氨基酸密码子进行目的基因的密码子优化，委托生物技术公司合成寡核苷酸，退火获得目的基因，并将目的基因克隆至原核表达载体pET32a（+）多克隆位点内。构建原核表达重组质粒（pET32a（+）/CEA580-598），将此重组载体转化E.coli菌株BL21（DE3表达融合蛋白，并经SDS-PAGE、Western Blot分析鉴定。用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白ozlf-75/76。
3.用纯化表位融合蛋白ozlf-75/76与佐剂混匀后，分别于0w、2w、4w背部多点免疫日本大耳白兔，共3次，于第5周对日本大耳白兔进行心脏采血，收获兔免疫后血清制备多克隆抗体，用Western blot方法进行特异性鉴定分析，ELISA法检测抗体水平以分析其免疫原性，进一步检测兔免疫血清与LOVO细胞抗原（CEA抗原）结合的抗体水平。
4.使用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学意义的分析。
结果：
1、目的基因筛选：选择CEA589-598（NRSDPVTLDVLYGPDTPⅡ）短肽，CEA580-584为预测的B细胞表位，CEA589-597为HLA-A2表位，CEA590-598既为H2-Kd限制性表位又为HLA-A24限制性表位。
2、多表位目的基因的原核重组质粒pET32a（+）/CEA580-598，经酶切和测序鉴定，构建成功。经SDS-PAGE分析表明，重组质粒在37℃条件下经1.0mM IPTG诱导6h能很好地表达目的蛋白，相对分子质量（Mr）约为21 kDa，与预期Mr大小吻合；并经Western blot鉴定为目的蛋白，即ozlf-75/76。用Ni-NTA树脂亲和层析法成功纯化表位融合蛋白ozlf-75/76。
3、所有日本大白耳兔在全程免疫后都产生了高效价的血清抗体，最高滴度达1：3200。Western blot检测结果显示，在相对分子质量（Mr）约为21 kDa处出现单一条带。获得了高效价的CEA580-598短肽日本大耳白兔免疫血清，兔免疫血清CEA抗原特异性抗体ELISA读数水平均值为0.39±0.10，SPSS13.0统计软件分析，实验组抗体水平与PBS和pET32a（+）对照组比较具有显著性差异（P=0.017）。
结论：
1、预测并筛选了富含CTL表位和B细胞表位的CEA580-598多表位肽，为肿瘤疫苗的设计提供了理论依据和实验基础。
2、通过分子克隆成功构建了整合有CTL和B细胞多表位的原核重组质粒pET32a（+）/CEA580-598，并在原核细胞表达系统内成功表达了融合蛋白ozlf-75/76。
3、CEA580-598短肽融合蛋白具有较强的免疫原性，免疫日本大耳白兔可成功制备高效价的血清特异性抗体，且能特异性结合CEA抗原，为建立CEA免疫检测打下了基础。