论文部分内容阅读
目的： 雄激素受体（AR）属于核受体超家族中的类固醇受体，在前列腺癌（PCa）的发生、发展过程中，雄激素依赖和AR结合，形成雄激素受体复合物，通过核孔复合体进行核转位转运至细胞核发挥生物学作用。肝细胞粘附分子（HepaCAM）是免疫球蛋白超家族成员之一，近年的研究发现它在多种肿瘤组织中缺失或者低表达，与肿瘤存在密切的关系，被认为属于肿瘤抑制因子之一。在本研究中，通过构建HepaCAM胞内结构域缺失腺病毒，旨在了解HepaCAM胞内结构域对PCa细胞株的生物学行为的影响，探讨HepaCAM胞内结构域对前列腺癌AR核转位的可能机制。 方法： 1.收集整理46例PCa患者的年龄、病理评分、临床分期等临床资料和PCa组织标本，同期收集46例良性前列腺增生（BPH）标本作为对照，采用免疫组织化学方法检测AR、Ran以及HepaCAM的蛋白表达状况，统计它们在 PCa和前列腺增生组织的表达差异，分析HepaCAM的表达水平和AR、Ran蛋白的相关性。同时分析HepaCAM与PCa临床病理参数之间的相关性。 2.构建完整包含HepaCAM和HepaCAM胞内结构域（264-461aa）缺失腺病毒，培养人PCa雄激素敏感型细胞株LNCaP细胞。1）绿色荧光下观察所构建病毒感染LNCaP细胞的效率，同时探索最佳病毒用量，提高后续实验的感染效率和细胞存活率。2）将培养的LNCaP细胞株分成Blank组、Vector组、HepaCAM组、HepaCAM-mt组4组，分别采用PBS、空载腺病毒、ad-HepaCAM、ad-HepaCAM-mt处理，并命名为Blank组、Vector、HepaCAM、HepaCAM-mt组，western blot检测LNCaP细胞株HepaCAM蛋白水平，了解所构病毒效能，为后续实验做好铺垫。 3.常规培养人PCa雄激素敏感型细胞株LNCaP细胞。设立Blank组、Vector组、HepaCAM组、HepaCAM-mt组，MTT实验对各处理组LNCaP细胞活性进行检测，克隆形成实验对各处理组LNCaP细胞增殖能力进行检测，Woundhealing实验分析各处理组LNCaP细胞迁移能力，Transwell实验了解各处理组LNCaP细胞的侵袭转移能力，最后采用western blot分别检测各处理组LNCaP细胞C-myc、和cyclin D1增殖相关分子的蛋白表达状况以及检测各处理组 LNCaP细胞E-cadherin，N-cadherin，Snail等侵袭相关分子的蛋白表达状况。 4.应用细胞免疫荧光技术检测、对比过表HepaCAM、HepaCAM-mt后LNCaP细胞中AR、Ran蛋白在细胞浆、核的分布状态。分析其与Blank组、Vector组之间的差异。ELISA方法分析、检测ad-HepaCAM、ad-HepaCAM-mt对各处理组LNCaP细胞分泌PSA的影响。Western blot技术分析、检测过表达HepaCAM、HepaCAM-mt后各处理组LNCap细胞中AR、Ran蛋白在细胞浆、核的表达变化。 结果： 1.在46例PCa病理组织中，通过免疫组化结果分析发现HepaCAM在PCa组织中的蛋白表达65.22%(30/46)为缺失，34.78%(16/46)表现为下调。我们进一步分析了PCa中HepaCAM的表达和临床病理特征的关系，证实HepaCAM的表达和PCa的Gleason评分存在明显相关， Gleason评分越高，HepaCAM越呈现出低表达，甚至缺失。通过半定量染色评分观察发现HepaCAM的表达与雄激素受体及Ran蛋白的表达成明显的负相关，两者比较有统计学差异（P＜0.01），HepaCAM与AR及Ran蛋白的相关系数分别为：-0.442及-0.565，越低的HepaCAM染色评分的组织，雄激素受体及Ran蛋白的评分反而越高。 2.为了研究HepaCAM及其胞内结构域在PCa中的功能，我们在课题组已经构建了ad-HepaCAM病毒的基础上进一步构建了HepaCAM胞内域缺失的腺病毒，命名为ad-HepaCAM-mt，经过病毒转染验证后检测HepaCAM及HepaCAM-mt蛋白的表达状况，结果显示成功构建ad-HepaCAM-mt，并能够高效感染LNCaP细胞，并持续稳定表达HepaCAM-mt蛋白，满足细胞实验的要求。 3.在雄激素敏感人前列腺癌细胞株LNCaP细胞中，HepaCAM过表达能够降低LNCaP细胞的增殖、克隆能力，而过表达HepaCAM-mt后并不能够使LNCaP细胞的增殖、克隆能力得到下降。对增殖、克隆相关蛋白检查发现，过表达HepaCAM后，LNCaP细胞中cyclin D1和C-myc的表达显著下降，而过表达HepaCAM-mt后，cyclin D1和C-myc的表达的水平和Blank组、Vector组类似，并没有得到显著下降。提示HepaCAM降低LNCaP细胞的增殖、克隆能力可能是通过其胞内结构域影响cyclin D1和C-myc的表达而起作用。 4.在研究HepaCAM对PCa侵袭、迁移能力的影响中，过表达HepaCAM能显著降低LNCaP细胞的侵袭、迁移能力，而过表达HepaCAM-mt后并不能够显著使LNCaP细胞的侵袭、迁移能力得到下降。对侵袭、迁移相关蛋白检查发现，过表达HepaCAM后，LNCaP细胞中N-cadherin和Snail的表达显著下降，E-cadherin轻度升高，而过表达HepaCAM-mt后，E-cadherin，N-cadherin和Snail的表达的水平和Blank组、Vector组类似，并没有得到显著下降。提示HepaCAM降低LNCaP细胞的侵袭、迁移能力可能是通过其胞内结构域影响E-cadherin，N-cadherin和Snail的表达而起作用。 5.PSA是反映PCa雄激素受体的功能靶基因之一，在LNCaP细胞培养液的上清中检测PSA的含量，HepaCAM组中PSA水平显著低于Blank组、Vector组，而HepaCAM-mt组的PSA水平和Blank组、Vector组接近。进一步了解AR在LNCaP细胞中的核转位状态，过表达HepaCAM能提高细胞浆中AR的表达，降低细胞核中AR的表达，显著抑制LNCaP细胞的AR核转位，而过表达HepaCAM-mt后并不能够提高细胞浆中AR的表达，降低细胞核中AR的表达，不能抑制LNCaP细胞的AR核转位。Ran蛋白是AR核转位过程中能量转换的关键蛋白，过表达HepaCAM能提高细胞浆中Ran蛋白的表达，降低细胞核中Ran蛋白的表达，将Ran蛋白阻止于细胞浆内，显著抑制Ran蛋白协同AR核转位。过表达HepaCAM-mt后并不能使提高细胞浆中Ran蛋白的表达提高，降低细胞核中Ran蛋白的表达。提示HepaCAM能够抑制AR核转位，这种机制可能是通过其胞结构域抑制Ran蛋白实现的。 结论： 在PCa中，HepaCAM通过其胞内结构域，抑制PCa雄激素受体核转位而起到抑制PCa的作用，这种抑制PCa雄激素受体核转位的机制可能是HepaCAM胞内结构域抑制Ran蛋白而实现的。