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在胚胎发育的过程中,造血和内皮细胞在发育时间和空间密切相关。一种观点认为造血细胞和血管内皮细胞来源于一个共同前体,即血液血管干细胞;另一种观点认为造血细胞来源于功能成熟的内皮细胞,即生血内皮。关于造血细胞的起源是胚胎造血发育研究的难点。其原因是由于造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)难以明确定位,进而无法揭示它的发育规律。作为造血组织的核心成分,HSC具有高度自我更新和在适当条件下向多个方向分化为各系造血细胞的能力。一方面可以维持机体干细胞池的动态平衡和机体的正常造血,另一方面又使其自身变成一个多类型细胞的混合体。HSC不是单一的细胞群体,而是由不同等级的干细胞所组成,它们的表面抗原、免疫表型和黏附分子表达不一。因此,为了更好的研究HSC的起源和发育动力学变化,发现和鉴定新的HSC特异性标记显的尤为重要。基质细胞OP9在研究造血和内皮细胞的关系以及鉴定血液血管干细胞分化功能中具有重要作用,因此我们首先对OP9的生物学性状进行了研究。从细胞形态、免疫表型、多向分化能力、免疫原性和免疫调节能力、迁移能力对OP9进行细胞学特性的鉴定。实验证明,OP9呈成纤维细胞状贴壁生长,具有成脂肪、成骨、成软骨三系分化的潜能。该细胞系不表达造血和内皮的标记(CD34、CD31、CD11b、CD45、Flk1),不表达免疫共刺激分子CD86和MHCⅡ类分子,表达间质细胞的标记CD44和CD29,表达干细胞标记Sca-1,表达血管周细胞的标记(CD140a、CD140b、α-SMA和Calponin)。某些因子如:bFGF、IGF-1、IL-3、PDGF-BB、TGF-β1和TGF-β3可以明显促进OP9细胞的迁移,而SDF-1α、BMP-2、BMP-4和VEGF的作用则较弱。OP9细胞能抑制有丝分裂原或异体淋巴细胞引起的T细胞增殖,具有免疫调节能力。上述数据表明OP9细胞具有MSCs典型特征,可用于今后在真正的干细胞水平研究MSCs。进而,我们将OP9引进血液和血管内皮细胞的发育分化研究中。我们对AGM区的细胞进行免疫磁珠分选,将Tie2+细胞种在预先铺有OP9的24孔板中,验证OP9支持造血和支持内皮生长的功能。基于OP9,我们建立了AGM区来源血液血管干细胞(即BL-CFC)的造血和内皮分化功能的鉴定体系。在一定条件下,BL-CFC与OP9细胞共培养,还可形成B淋巴细胞,证明BL-CFC具有定向造血的潜能。为探索胚胎造血发育的特异性标记,我们从多个造血前体类型(包括:髓系祖细胞、生血内皮细胞、B淋巴细胞前体、BL-CFC、HSC)入手,重点研究Flk-1和CD43的标志意义。首先,我们分离E10.5、E11.5、E12.5各时间点AGM区,用Ⅰ型胶原酶消化成单细胞悬液后,进行磁珠分选,分别进行计数。按照一定细胞数目接种于甲基纤维素半固体体系中,在细胞因子SCF、IL-6、IL-3、EPO存在的条件下,进行CFU-C培养。发现Flk-1+细胞不能完全富集CFU-C,其形成髓系祖细胞的能力在E10.5最强,之后趋于下降。相比,所有髓系祖细胞均表达CD43。CFU-C反映了已经定向的造血祖细胞的数量,而生血内皮细胞的定量可通过OP9上造血簇的形成完成。结果表明:在细胞因子SCF、IL-3、FL、VEGF作用下,Flk-1+细胞在OP9细胞上形成造血细胞簇的效率高于Flk-1-细胞。Flk-1+细胞和Flk-1-细胞在OP9上生长7天后,非贴壁细胞均表达造血细胞的表面标志CD45、Mac-1/Gr-1、B220、CD19等。Flk-1-细胞CD45、c-Kit表达比例均低于Flk-1+细胞,但Ter119比例较高。说明Flk-1-细胞形成的造血细胞簇分化形成红细胞的能力更强,而Flk-1+细胞c-Kit比例高,可能暗示其形成造血干祖细胞的能力更强。同样,将贴壁细胞进行免疫组化。发现Flk-1+细胞和Flk-1-细胞在OP9上生长7天后,贴壁细胞均表达内皮细胞的表面标志CD31、Endomucin,并且Flk-1+细胞可以在OP9上形成明显的管网状结构,Flk-1-细胞只能形成少量的管状结构。相比,仅CD43+细胞可形成造血细胞簇。CD43+细胞在OP9细胞上生长7天后,非贴壁细胞也表达髓系和淋系的表面标志,但将贴壁细胞进行免疫组化,发现CD43+群和CD43-群在OP9上的贴壁细胞均表达内皮细胞的表面标志CD31、Endomucin,提示CD43可区分生血和非生血内皮细胞。基于OP9细胞,我们研究了胚胎造血前体分子Flk-1和CD43分别与B淋巴细胞发育的关系。发现在FL、IL-7等作用下,AGM区的Flk-1+细胞和Flk-1-细胞均有向B淋巴细胞分化的潜能。但只有CD43+细胞有向B淋巴细胞分化的潜能。之后,借助于甲基纤维素半固体体系,在细胞因子SCF、IL-6、IGF-1、VEGF、LIF、bFGF存在的条件下,我们研究了Flk-1和CD43在BL-CFC中的表达情况。结果发现Flk-1+细胞形成BL-CFC的效率高于Flk-1-细胞。与Flk-1不同的是,BL-CFC仅集中在CD43+细胞生长,CD43-群细胞未见任何明显集落生长。最后,我们考察了Flk-1在HSC中的表达情况。常规分离不同时间点小鼠GFP+AGM区和胎肝细胞,制备成单细胞悬液,分选后,经尾静脉进行移植。移植4个月后,采集受体外周血进行流式细胞分析,以嵌合率≥10%为标准,发现E11.5、E12.5的AGM区和E12.5的FL中Flk-1+细胞和Flk-1-细胞均具有长期重建致死剂量照射小鼠造血系统的能力。为了进一步分析其在体内多系分化潜能,我们分别对受体外周血进行了髓系标志Mac-1/Gr1、B淋巴细胞标志B220、T淋巴细胞标志CD3检测,均发现有相当比例的供体来源的髓系和淋系嵌合。此外,我们对对部分重建受体的胸腺、脾脏、骨髓进行了检测,均发现供体嵌合,表明Flk-1+细胞和Flk-1-细胞来源的造血细胞均具有向多系分化潜能。为了验证HSC的自我更新能力,我们将已重建受体的骨髓进行二次移植,移植两个月后,发现受体重建,说明上述细胞能够短期重建致死剂量照射小鼠造血系统。以上数据表明:AGM区来源的Flk-1+细胞和Flk-1-细胞均含有真正的HSC。