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目的探讨STAT3抑制剂反馈性激活EGFR及体内外联合大黄酸和EGFR抑制剂协同对结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移等活性研究。方法第一部分1.通过Western blot检测STAT3小分子抑制剂(LY5)对结直肠癌细胞p-STAT3,p-EGFR(Y1068),p-ERK1/2,和p-AKT表达的影响。利用细胞划痕实验探索STAT3小分子抑制剂(LY5)及EGFR抑制剂(Erlotinib)单用或联用对结直肠癌HCT-116和DLD-1细胞系细胞迁移能力的影响。MTT实验检测STAT3抑制剂(LY5)与EGFR抑制剂(Erlotinib)单用或联用对HCT-116和DLD-1细胞生存率的抑制。2.大黄酸在化学结构上与已知的四个STAT3抑制剂Napabucasin、STA-21、LLL12和LY5的结构相似,利用STAT3 SH2结构域的分子对接模拟实验,计算机辅助的分子对接结果初步模拟显示大黄酸与STAT3蛋白之间的作用关系。3.在结直肠癌细胞株HCT-116和SW-620中,实验分四组(DMSO/大黄酸/Erlotinib/Erlotinib+大黄酸),利用MTT实验检测IC50并计算生存率,表明大黄酸与EGFR抑制剂Erlotinib单用或联用对结直肠癌细胞生存率的影响,通过Western blot检测大黄酸对结直肠癌细胞p-STAT3表达的影响。4.利用流式周期实验探索大黄酸及EGFR抑制剂Erlotinib单用或联用对结直肠癌HCT-116和SW-620细胞系细胞周期的影响,检测Clin B1与CDC2细胞周期阻滞相关蛋白的表达情况,在机制上阐述大黄酸和Erlotinib单用或联用对结直肠癌细胞的周期阻滞效应。5.通过对结直肠癌细胞进行流式凋亡实验,检测早期凋亡和晚期凋亡比例作统计分析,利用Western blot实验检测HCT-116细胞的凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平,反应大黄酸和Erlotinib单用或联用对结肠癌细胞凋亡的诱导效果。6.利用显微镜下观察HCT-116结肠癌细胞形态的变化情况及细胞集落实验考察大黄酸和Erlotinib单用或联用对HCT-116结直肠癌细胞细胞形变和集落形成能力的影响。第二部分1.构建裸鼠肿瘤模型,将实验裸鼠随机分成四组(对照组/大黄酸/Erlotinib/Erlotinib+大黄酸),给药期间拍照并记录裸鼠体重变化,肿瘤体积及质量,绘制相关曲线图。2.通过蛋白免疫印迹实验检测p-STAT3和p-EGFR及促凋亡蛋白Bax的表达,探究单药与联合给药在体内的抗肿瘤作用。3.通过比较裸鼠每组给药之前与给药之后的小鼠体重变化情况,及组织分析结果,评估大黄酸及Erlotinib联合给药后的安全性。结果1.Western blot实验检测p-STAT3,p-EGFR(Y1068),p-ERK1/2,和p-AKT,发现结直肠癌细胞中LY5作为STAT3抑制剂,也可以诱导EGFR磷酸化增加,进而激活EGFR信号通路。细胞划痕实验证明STAT3抑制剂(LY5)及EGFR抑制剂(Erlotinib)联用明显抑制结直肠癌HCT-116和DLD-1细胞系细胞迁移能力,差异存在统计学意义(P<0.05)。MTT实验表明联用STAT3抑制剂(LY5)与EGFR抑制剂(Erlotinib)对HCT-116和DLD-1细胞生存存在明显抑制,差异存在统计学意义(P<0.05)。2.分子对接模拟实验结果显示大黄酸可能与STAT3蛋白直接结合并影响其Y705磷酸化活性位点。3.从分子细胞层面上,通过Western blot检测p-STAT3(Y705)结果显示大黄酸能抑制结直肠癌细胞STAT3的磷酸化激活,从而抑制结直肠癌细胞增殖和促进凋亡。根据MTT实验也发现,大黄酸可剂量依赖性地抑制结直肠癌细胞的生长。Erlotinib作为EGFR抑制剂,联合大黄酸,对结直肠癌细胞的抑制活性明显优于两者单独用药,且差异存在统计学意义(P<0.05)。细胞周期实验表明,两药协同显著增强细胞G2/M期的阻滞作用,下调Clin B1与CDC2细胞周期阻滞相关蛋白的表达,进一步证实大黄酸和Erlotinib联合较单用对结直肠癌细胞的周期阻滞效应增强,差异存在统计学意义(P<0.05)。流式细胞凋亡结果及Western blot表明大黄酸可促结直肠癌细胞系凋亡,联合用药的细胞凋亡率及下调Bcl-2的表达水平明显优于单纯给药,证明大黄酸联合Erlotinib可协同诱导结直肠癌细胞的凋亡,差异存在统计学意义(P<0.05)。大黄酸可抑制HCT-116细胞集落形成及促使细胞形态改变。结果证实在结直肠癌细胞系中联合EGFR抑制剂(Erlotinib)和大黄酸比单独使用抑制剂能明显减弱细胞活力。4.裸鼠体内实验上进一步研究质量结果图发现单独给药组大黄酸和Erlotinib体重增长缓慢,肿瘤质量较对照组减轻,联合给药组体积及质量明显低于对照组及单药组,提示联合用药可显著抑制肿瘤增长,裸鼠的肿瘤Western blot证实联合用药上调促凋亡蛋白Bax的表达水平,较单纯用药明显抑制p-STAT3和p-EGFR的表达。组织分析结果提示联合给药对小鼠的正常组织(心脏、肝脏及肾脏)无明显毒性。结论1.在分子及细胞层面发现STAT3抑制剂能反馈性激活EGFR信号通路,联合STAT3和EGFR的抑制剂发挥协同抗肿瘤作用。2.新型STAT3抑制剂大黄酸具有较好的抗肿瘤活性,基于大黄酸与STAT3分子模拟对接,STAT3可能是大黄酸的直接作用靶点。3.在细胞学水平上发现大黄酸抑制STAT3发挥抗肿瘤效果,及增敏EGFR抑制剂抑制细胞活力。以及大黄酸和EGFR抑制剂联用协同促进细胞凋亡和抑制细胞增殖。4.在动物层面同样说明大黄酸和EGFR抑制剂具有很好的协同抗肿瘤作用,大黄酸能有效逆转EGFR抑制剂耐药以及具有良好的安全性。