背景及目的：　　 糖尿病发病率逐年升高,目前全世界糖尿病患者已超过2亿人,是严重危害人类健康的常见病之一。目前研究认为胰岛移植是治疗1型糖尿病的有效手段之一,胰岛移植具有操作简单、安全性高、并发症少及可重复性高等优势。2000年Edmonton方案的成功,标志着胰岛移植取得了突破性的进展。但是分离大量高纯度胰岛仍有一定困难,而且胰岛在分离过程中其生存微环境遭到破坏,移植到体内后缺血缺氧、炎症和免疫排斥反应等不利因素使大量胰岛细胞发生调亡,这些因素都导致从单个供体胰腺获取的胰岛数量远不能满足一个受体的需求。解决供胰短缺一种最有效途径是在实验室建立可供移植并分泌胰岛素的细胞系。该细胞系应具有正常胰岛β细胞特征,对血糖浓度变化敏感,根据血糖浓度变化合成和分泌胰岛素。　　 猿猴病毒40大T抗原基因(simian virus40 largeT antigen gene,SV40 Ltag)是最早被用来实现细胞的永生化的基因,目前已经成功的介导了多种细胞的永生化,如肾上腺嗜铬细胞、上皮细胞、肝细胞等真核细胞。SV40由结构蛋白(VP1,VP2,VP3)和两种抗原(LT和st)组成,其中LT具有调控某些关键的肿瘤抑制因子和细胞周期调节蛋白的作用,它能结合肿瘤抑制因子p53和pRb,降低它们对细胞增殖的抑制作用,同时还有ATP酶和DNA解旋酶活性,能使ADP羰基化和乙酰基化、蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化,活化宿主细胞核糖体基因,诱导DNA合成,修饰蛋白质合成起始因子等作用。目前SV40 Ltag已被广泛地应用于细胞生物领域,以促使。　　 本研究拟利用SV40 Ltag促使原代成纤维细胞发生永生化,以增加原代细胞的体外增殖能力。但是如果SV40 Ltag长期存在于细胞内,可导致潜在的致瘤性。因此从生物安全角度出发拟建立的杂交胰岛β细胞在移植到体内之前需要将SV40Ltag基因切除。本研究拟应用条件基因敲除技术—Cre/LoxP位点重组酶系统,联合基因转染和细胞融合技术介导细胞永生化,又称可复性永生化(reversibleimmortalization),建立增殖可控、功能良好、无致瘤性的杂交胰岛β细胞系,从而为解决移植胰岛β细胞短缺提供新的思路及途径。　　 方法：　　 (1)采用酶消化法提取胎鼠原代皮肤成纤维细胞,采用脂质体法将逆转录病毒载体SSR69转染原代大鼠成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTAg的永生化成纤维细胞。倒置显微镜观察原代和永生化成纤维细胞形态,采用生长曲线法观察它们体外增殖能力,细胞免疫荧光检测其表达特性。用表达Cre重组酶的腺病毒上清感染永生化成纤维细胞,筛选回复后成纤维细胞,采用平板克隆实验测定回复后细胞的致瘤性。分别用RT-PCR及Western blot技术,在mRNA及蛋白水平,检测SV40 LTAg基因在永生化细胞中的表达情况以及在回复后细胞中的切除情况。　　 (2)采用改良的明尼苏达大学方法分离纯化原代大鼠胰岛,以DTZ染色、AO/PI荧光染色、葡萄糖刺激胰岛素分泌实验鉴定大鼠胰岛的产量、纯度、活性及功能；采用胰酶和DNA酶消化胰岛细胞,获取胰岛单细胞悬液,AO/PI染色及葡萄糖刺激胰岛素分泌实验测定胰岛单细胞的活性及功能。　　 (3)采用电融合的方法将永生化成纤维细胞与胰岛单细胞融合,采用有限稀释法筛选杂交胰岛β细胞克隆。对杂交胰岛β细胞进行扩大培养,倒置显微镜下观察其形态,透射电镜观察其超微结构,绘制生长曲线测定其体外增殖能力。比较杂交胰岛β细胞和原代胰岛β细胞内胰岛素含量的差异,采用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验测定二者对葡萄糖变化的敏感性的差异。分别以永生化成纤维细胞和胰岛β细胞为对照,应用RT-PCR、Western blot在mRNA和蛋白水平检测SV40 Ltag、Insulin、GK和Glut-2在杂交胰岛β细胞中的表达情况,取不同代数的细胞检测SV40 Ltag的表达情况。　　 结果：　　 (1)成功提取大鼠皮肤成纤维细胞,逆转录病毒载体SSR69转染原代大鼠成纤维细胞后筛选出永生化成纤维细胞,两者细胞形态无明显差异,均贴壁生长,呈长梭形或多角形,但永生化成纤维细胞体外增殖能力明显高于原代成纤维细胞(P＜0.05),可以在体外培养传代＞25代。细胞免疫荧光提示两种细胞均在细胞质内表达Vimentin。SV40 Itag基因在永生化细胞内稳定表达,用表达Cre重组酶的腺病毒成功切除永生化细胞内的SV40 Ltag基因,从而获得回复后成纤维细胞,其体外增殖能力与原代细胞无明显差异(P＞0.05),无致瘤性。　　 (2)成功分离纯化出纯度＞95％、存活率＞95％的原代大鼠胰岛细胞,成功将胰岛细胞消化分散成功能良好的胰岛单细胞,胰岛素释放指数＞3,活性＞90％。　　 (3)成功筛选出杂交胰岛β细胞克隆,贴壁生长,呈短梭形或扁圆形,透射电镜可以观察到细胞内有胰岛素分泌颗粒,细胞内胰岛素含量及胰岛素释放指数与原代胰岛β细胞相比,均无统计学差异(P＞0.05)。杂交胰岛β细胞在体外培养传代至10代以上,但随着培养时间的延长,至第12代其增殖能力减弱。RT-PCR及Western blot提示第8代和第12代杂交胰岛β细胞在mRNA和蛋白水平均表达SV40 Ltag。杂交胰岛β细胞Insulin、GK、Glut-2 mRNA和蛋白的表达量与原代胰岛细胞相比,均无统计学差异(P＞0.05),与RIN-m5F细胞相比,均显著增高(P＜0.05)。　　 结论：　　 (1)脂质体可以成功介导逆转录病毒载体SSR69转染大鼠成纤维细胞,从而获得永生化大鼠成纤维细胞,此种永生化成纤维细胞可在体外持续增殖、稳定传代＞25代,而且表达特性未发生变化。　　 (2)以Cre/LoxP系统可以切除永生化大鼠成纤维细胞内的SV40 Ltag基因,从而获得回复后成纤维细胞,回复后成纤维细胞生长特征与原代细胞相似,无致瘤性。　　 (3)采用电融合的方法可以将永生化成纤维细胞与胰岛单细胞融合,并最终获得杂交胰岛β细胞克隆。此杂交胰岛β细胞对葡萄糖变化有一定敏感性,可以根据葡萄糖浓度的变化合成和分泌胰岛素,但随着培养时间的延长,其增殖能力减弱。在细胞内胰岛素含量、胰岛素释放指数及Insulin、GK、Glut-2的表达量上,与原代胰岛细胞之间无统计学差异。