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为研究亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenee)幼虫体内酚氧化酶原激活蛋白酶(prophenoloxidase activating proteinase,PAP)表达调控的分子机理,本研究通过RACE技术获得该基因的cDNA序列,对PAP基因序列进行了生物信息学,通过原核表达并纯化了表达产物,采用Western blot和酶活测定进行鉴定。对玉米螟幼虫进行细菌注射,通过Real timePCR检测注射前后PAP基因在不同组织中mRNA水平上的表达变化情况。主要研究结果如下：(1)采用RT-PCR及RACE技术从亚洲玉米螟幼虫中克隆PAP基因全长cDNA序列。该基因全长1455bp,开放阅读框为1200bp,编码400个氨基酸；5’和3’非编码区分别为66bP和189bp。PAP的计算分子量约为44.8kDa,估测等电点pI为6.66。生物信息学分析表明：该基因序列中含有丝氨酸蛋白酶样结构域中保守的催化三联体,含有两个发夹结构域(Clip),分别为位于23-70位氨基酸的结构域和153-394位氨基酸的结构域,其中153-394位氨基酸也被称为丝氨酸蛋白酶结构域(serine proteinase,SP)。PAP蛋白无跨膜结构域,无糖基化位点,N端含有信号肽,切割位点为18与19位氨基酸之间,含有19个磷酸化位点均匀分布于整个多肽链中。BlastP分析结果表明：该片段的氨基酸序列与鳞翅目烟草天蛾Manduca sexta PAP3precursor、Manduca sexta PAP3、Manduca sexta PAP2、家蚕Bombyx mori PPAE、蓖麻蚕Samia cynthia ricini PAP和斜纹夜蛾Spodoptera litura PPAE3氨基酸序列具有较高的同源性,其氨基酸一致性在37%以上。构建系统发育树,对其进化关系进行了初步分析,结果显示：亚洲玉米螟PAP与烟草天蛾PAP3和斜纹夜蛾PPAE3的亲缘关系较近,与甲壳纲的印度明对虾Fenneropenaeus indicus PPAF和斑节对虾Penaeus monodon PPAE亲缘关系较远。(2)为了对PAP蛋白进行结构分析,对PAP含有第二个Clip(153-394位氨基酸)的丝氨酸蛋白酶(SP)结构域进行了亚克隆,分别获得了3个不同片段：PAP-SP1(144-400位氨基酸)、PAP-SP2(154-400位氨基酸)和PAP-SP3(44-400位氨基酸)。采用pET表达系统对PAP蛋白和SP结构域分别进行了原核表达,PAP全酶蛋白在IPTG的梯度诱导之后在沉淀均有大量表达,重组表达的蛋白质分子的大小与预测蛋白分子量大小一致,约为46.64kDa。pET-28b-PAP-SP1在37℃温度下,可以明显看到0.2mmol/L和0.1mmol/L IPTG诱导下有明显的蛋白表达。pET-28b-PAP-SP2在28℃温度诱导下,可以明显观察到0.1mmol/L IPTG诱导下蛋白在上清有明显表达。PAP-SP3通过构建融合表达载体并进行诱导表达发现pET-28a-HMsbT-PAP-SP3在25℃温度、0.1mmol/L IPTG诱导时有较为明显的上清蛋白表达。通过FLAG标签蛋白的单克隆抗体对原核表达的PAP-SP3进行Western blot验证,结果与SDS-PAGE一致,然后对大量表达的蛋白进行Ni2+柱纯化,结果在洗脱液1(Elution1)中获得了HMsbT-PAP-SP3重组蛋白。采用测定PAP蛋白的酰胺酶活测定方法,以乙酰基-异亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-精氨酸-对硝基苯胺(acetyl-Ile-Glu-Ala-Arg-p-nitroanilide,IEARpNa)为底物进行了表达产物酶活的初步测定。其中]PAP、PAP-SP1、PAP-SP2分别以含有重组质粒的表达菌株在无IPTG诱导和0.1mmol/L IPTG诱导下,破碎细菌后对菌液上清进行酶活测定,结果表明均有活性,分别为139.2U/mg、1853.1U/mg、1743.3U/mg,但无IPTG诱导下的菌液上清也有蛋白活性,分别为25.0U/mg、1573.6U/mg、568.7U/mg,诱导前后菌液上清蛋白的比活力无显著差异(P>0.05)。对纯化获得的HMsbT-PAP-SP3重组蛋白PAP-SP3进行活性测定,结果显示其比活力为1135.1U/mg。以上结果表明：我们己成功获得PAP蛋白及其SP结构域的表达产物,且纯化获得HMsbT-PAP-SP3具有较高的比活力重组蛋白。(3)为研究细菌(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)注射对亚洲玉米螟幼虫体内PAP基因转录水平的影响,对玉米螟幼虫进行生理盐水、革兰氏阴性菌大肠杆菌及革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌注射,并通过Real time PCR检测注射后不同时间(0h、4h、8h、12h、24h、36h)PAP基因在不同组织(血细胞、脂肪体、中肠、体壁)中的表达变化。结果表明：亚洲玉米螟血细胞中PAP基因的表达只在大肠杆菌注射后有显著的变化,4h时剧烈上升达到了115.3±23.2倍,随后又急剧下降,而在其他诱导物诱导后无显著变化(P>0.05)。脂肪体中PAP mRNA的表达整体上变化不显著(P>0.05)。在中肠中,枯草芽孢杆菌注射处理与对照组相比PAP mRNA的表达有明显差异(P>0.05),并随时间变化有上升的趋势,在36h时PAP mRNA表达量最高,达到了107.6±7.2倍,其他处理组无显著变化(P>0.05)。在体壁中,不同的注射处理与对照组相比PAP mRNA的表达均有一定程度的升高,其中枯草芽孢杆菌处理组表达最为明显,在12h时PAP mRNA表达量达到了对照组的105.2±1.6倍,生理盐水处理组在8h达到了36.4±0.5倍,大肠杆菌处理组在36h时也达到了21.3±0.3倍。