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缺血/再灌注是机体或某个器官血供中断或不足,随后组织器官灌流恢复再充氧而造成的一种病理状态。较常见的就是动脉血流被栓塞物阻塞,导致严重的代谢物供给失调,最终导致组织缺氧坏死。恢复血流和氧气供给后,组织损伤会加重,并且伴随产生较为严重的病理反应,称为再灌注损伤。当脑组织缺血缺氧后再次恢复血供的过程中,微环境中会产生大量损伤性因子如氧自由基等,对线粒体功能产生影响。该过程不仅对细胞内生物膜产生损伤,还会对细胞核内DNA和组蛋白造成影响,诱发细胞启动凋亡程序。由于神经细胞具有不可再生性,所以脑缺血再灌损伤造成的后果极为严重。目前对于缺血/再灌注损伤的治疗手段主要有缺血预处理、代谢的策略增加缺血耐受、气体治疗、核苷酸和核苷信号治疗以及通过Micro RNAs治疗。但这些方法都存在一些缺陷和不足,在治疗的效果方面也差强人意,因此寻找其他有效的治疗方案或者治疗药物就显得格外重要。梓醇(Catalpol)是近年来新发现的一种糖苷,来源于中药成分。1969年首次分离提纯,它能透过血脑屏障进入血液循环发挥多种生物学作用如抑制炎性反应、抑制肿瘤细胞、延迟衰老以及护肝养肝等多种药理作用。本实验采用传统大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的方法来模拟缺血状态,制作大鼠局灶性脑缺血模型,探究梓醇对大鼠脑组织局部缺血后恢复血供所造成损伤后的保护作用。实验一、梓醇对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的治疗作用目的:探讨梓醇对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的治疗作用。方法:雄性SD大鼠(280-320 g)24只,随机分为4组(n=6):①MCAO组:MCAO模型(缺血120min);②溶剂对照组(Vehicle组):缺血120min/再灌注后腹腔注射0.1mol/l的DMSO;③梓醇1mg/kg组(Catalpol-1组):缺血120min/再灌注后腹腔注射1mg/kg的梓醇;④梓醇5mg/kg组(Catalpol-5组):缺血120min/再灌注后腹腔注射5mg/kg的梓醇。再灌注48h后,对四组大鼠进行神经行为缺陷评分NDS和TTC染色。结果:缺血再灌48h,与MCAO组相比Catalpol 1mg/kg和Catalpol 5mg/kg组大鼠的神经功能缺陷评分明显较低(P<0.05)。与MCAO组相比Catalpol 1mg/kg和Catalpol 5mg/kg组大鼠损伤后48 h脑梗死容积百分比显著下降。结论:梓醇能显著减少大鼠大脑的缺血/再灌注损伤,对大鼠大脑神经系统功能具有很好的保护作用。实验二、梓醇对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤后神经元凋亡的影响目的:探讨梓醇对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤后神经元凋亡的影响。方法:另取雄性SD大鼠(280-320 g)24只,随机分为4组(n=6):假手术组(Sham组);MCAO组;溶剂对照组(Vehicle组);梓醇组(Catalpol组)。Sham组动物单纯进行手术操作,不进行MCAO模型构建;MCAO组、Vehicle组、Catalpol组大鼠进行MCAO模型构建处理,建立方法同实验一,再灌注48h后,运用TUNEL免疫荧光染色检测各组大鼠神经元的凋亡,用Western blot检测对凋亡蛋白的影响。结果:TUNEL染色结果发现,Sham组几乎无染色阳性细胞,其余三组凋亡明显;MCAO组TUNEL染色阳性明显多于Catalpol组(P<0.05),表明梓醇处理组神经元的凋亡数量明显较少。Western blot检测发现,与Sham组相比,I/R后48h Cataipol组和MCAO组Bcl-2表达明显减少,Bax和Cleaved caspase-3表达明显增高(P<0.05);但与MCAO组相比,Cataipol组Bcl-2水平明显较高,Bax和Cleaved caspase-3水平明显较少(P<0.05)。结论:梓醇通过抑制大鼠脑缺血再灌后神经元的凋亡,起到大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的保护作用。实验三、梓醇对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤后氧化应激水平的影响目的:探讨梓醇对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤后抗氧化物酶、GSH-PX和MDA水平的影响。方法:另取雄性SD大鼠(280-320 g)24只,随机分为4组(n=6):假手术组(Sham组);MCAO组;溶剂对照组(Vehicle组);梓醇组(Catalpol组)。Sham组动物单纯进行手术操作,不进行MCAO模型构建;MCAO组、Vehicle组、Catalpol组大鼠进行MCAO模型构建处理,建立方法同实验一,并于再灌注后48 h,用Elisa检测脑组织SOD、Catalase、GSH-PX和MDA水平。结果:再灌注后48h,与MCAO组相比Catalpol组大鼠I/R后脑组织内GSH-PX活性明显较高(P<0.05),I/R后脑组织内MDA含量明显较低(P<0.05),血浆中Catalpol组SOD活性及Catalase活性均明显增强(P<0.05)。且再灌注48h后MCAO组GSH-PX、SOD及Catalase活性明显低于Sham组(P<0.05)。结论:梓醇具有清除自由基的神经保护作用,其机制可能通过增加GSH-PX活性和降低MDA水平来治疗大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤。实验四、NADPH氧化酶与梓醇脑保护机制关系研究目的:探讨梓醇脑保护机制及NADPH氧化酶的关系方法:取雄性SD大鼠(280-320 g)24只,随机分为4组(n=6):假手术组(Sham组);MCAO组;溶剂对照组(Vehicle组);梓醇组(Catalpol组)。Sham组动物单纯进行手术操作,不进行MCAO模型构建;MCAO组、Vehicle组、Catalpol组大鼠进行MCAO模型构建处理,建立方法同实验一,再灌注48h后,运用Western blot检测对NOX2含量的影响。另取雄性SD大鼠(280-320 g)36只,随机分为6组(n=6):①MCAO组:MCAO模型(缺血120min);②溶剂对照组(vehicle组):MCAO前腹腔注射PBS2μL;③DMSO组:MCAO前腹腔注射0.1mol/l的DMSO;④TBCA组:MCAO前60min腹腔注射TBCA(20nmol in 2μL of 50%(v/v)DMSO in PBS),NADPH氧化酶的激动剂;⑤梓醇5mg/kg组(Catalpol组):MCAO前30min腹腔注射5mg/kg的梓醇;⑥梓醇+TBCA组(Catalpol+TBCA组):MCAO前60min腹腔注射TBCA(20nmol in2μL),MCAO前30min腹腔注射Catalpol 5mg/kg。进行神经行为学评分,脑梗死溶剂测定,血浆及脑组织内抗氧化物酶活性及MDA含量测定。结果:Western blot检测发现,再灌注48h后,与Sham组相比,Cataipol组和MCAO组NOX2蛋白表达明显增高(P<0.05),Cataipol组增高程度较MCAO组少(P<0.05)。再灌注48 h后大鼠神经功能缺陷评分Catalpol显著低于MCAO组(P<0.05),而Catalpol+TBCA组显著高于Catalpol组(P<0.05)。再灌注48 h后大鼠脑梗死容积在Catalpol组显著低于MCAO组(P<0.05),而Catalpol+TBCA组显著高于Catalpol组(P<0.05)。与MCAO组相比,血浆中或是脑组织中,梓醇可增加SOD和Catalase的活性,以及MDA的含量;而与Catalpol组相比,TBCA+Catalpol组则SOD活性、Catalase活性显著减少,并且伴随着MDA含量的增加。结论:梓醇对脑组织保护作用机制为增加抗氧化物酶SOD和Catalase的活性,同时减少MDA的含量,增加机体的抗氧化能力。并通过影响细胞内Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3水平影响细胞凋亡。NOX2激动剂TBCA可逆转梓醇的脑保护作用,因此推测梓醇保护脑缺血/再灌注后神经系统的机制与抑制NOX2的生物学作用有关。小结梓醇可减少大鼠局灶性脑I/R损伤后的脑梗死容积,改善NDS评分,具有良好的治疗作用,其机制可能是通过增加抗氧化蛋白酶,GSH-PX活性和降低MDA水平,并通过影响NOX2水平抑制氧化损伤,还可以通过作用于Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3等凋亡蛋白,抑制缺血后神经元的凋亡达到脑保护作用。