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维持基因组的稳定性和完整性对于所有生物至关重要。DNA损伤能导致基因组不稳定、机体早衰、发育障碍、甚至癌症。DNA修复酶是一类参与DNA损伤修复的酶,其主要功能是特异性识别由各种内在或外在因素导致的DNA损伤,并利用各种修复途径修复这些损伤。DNA修复酶的异常表达与衰老、心血管疾病、人体免疫缺陷、神经退行性疾病和癌症密切相关,可作为疾病和癌症诊断的重要生物标志物。检测DNA修复酶的传统方法包括酶联免疫吸附法、基于放射性标记的凝胶电泳法、质谱法、高效液相色谱法和基于PCR的扩增法等。这些方法存在灵敏度差、放射性污染、仪器复杂昂贵、分析时间长、操作步骤繁琐等局限性,限制了这些方法的临床应用。因此,迫切需要发展简单、快捷、超灵敏检测DNA修复酶的新方法。本论文以端粒酶、尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase,UDG）、人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶（human alkyladenine DNA glycosylase,hAAG）和人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶（human 8-oxoG DNA glycosylase 1,hOGG1）为研究模型,结合等温扩增技术、荧光光谱分析、单分子检测技术、量子点和磁珠等新型纳米材料,发展了一系列灵敏度高、选择性好、背景信号低、操作简单、可同时分析多种DNA修复酶的方法。具体研究内容如下:（一）发展了可在单细胞水平超灵敏检测宫颈癌细胞中端粒酶活性的“三重信号放大”方法。该方法包括以下四个步骤:（1）端粒延伸反应;（2）脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1）介导的辅助探针循环切割,产生大量引物;（3）滚环扩增（rolling circle amplification,RCA）反应;（4）APE1催化的信号探针循环切割,产生增强荧光信号。首先端粒酶识别并延长端粒酶引物,在引物的3’端添加大量端粒重复单元（TTAGGG）,形成长单链DNA（ssDNA）。具有无碱基位点（AP位点）的辅助探针可以与延伸产物杂交,形成双链DNA（dsDNA）。APE1能够循环切割双链DNA中的AP位点,产生带有游离3’-OH末端的新单链DNA引物。在DNA聚合酶作用下,具有游离3’-OH末端的新DNA引物可与环状模板杂交,引发滚环扩增反应,产生大量与信号探针互补的长重复DNA序列。最后,信号探针与滚环扩增产物杂交,形成具有AP位点的双链DNA,启动APE1诱导的信号探针循环切割,释放大量荧光分子。该方法的创新之处在于每种端粒酶的扩增产物都可以诱导产生大量新DNA引物,这些引物可以引发大量滚环扩增反应,产生超长单链DNA分子。每个滚环扩增产物具有许多重复序列单元,并且每个重复单元可以诱导大量信号探针的切割,释放大量荧光分子,产生显著放大的荧光信号,可以对单个细胞内端粒酶进行定量检测。（二）发展了基于单个量子点（quantum dot,QD）的多层多受体纳米传感器,通过APE1介导的循环切割诱导的信号放大和多个Cy5受体介入的荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）超灵敏检测hAAG活性。当hAAG存在时,hAAG识别次黄嘌呤/胸腺嘧啶（I/T）碱基对,并在脱氧核糖和次黄嘌呤碱基之间裂解N-糖苷键,切掉黄嘌呤碱基形成AP位点。APE1酶能够裂解AP位点,导致发夹探针断裂成两部分,产生触发探针。产生的触发探针能和AP探针配对,形成双链DNA。随后,APE1酶诱导dsDNA循环裂解,产生大量有3’-OH的引物。所产生的引物可以在Klenow片段聚合酶、Cy5-dATP、dCTP、dGTP和dTTP存在时,以5’端标记生物素的捕获探针为模板引发聚合反应,生成稳定dsDNA并嵌入多个Cy5分子。这些含生物素和多个Cy5标记的dsDNAs可以通过生物素和链霉亲合素的特异性结合自组装到QD表面,形成QD-dsDNA-Cy5纳米结构。在405 nm激光激发下,605QD（供体）和Cy5（受体）之间发生荧光共振能量转移。Cy5荧光信号可以通过全内反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence,TIRF）检测,用于定量分析hAAG活性。该方法可以将包含多个Cy5分子的探针多层组装到单个QD表面,导致FRET信号显著放大。我们通过实验和理论验证了这个包含单供体多层受体的FRET模型。该方法的检出限低至4.42×10-12 U/μL,能够从单个癌细胞中检测hAAG,并且能有效区分癌细胞与正常细胞。这种基于QD的纳米传感器可用于抑制剂筛选和酶动力学参数测定,与相应DNA底物相结合可进一步用于检测其它DNA修复酶。（三）发展了一种碱基切除修复（BER）启动的核酸内切酶IV（Endo IV）介导信号扩增的单分子检测方法,可以同时检测hOGG1和UDG。我们分别设计了用两个8-oxoG碱基和五个尿嘧啶碱基修饰的两个辅助探针,它们可以与两个触发探针杂交分别形成hOGG1和UDG的DNA双链底物（检测探针）。我们设计了两种磁珠共轭信号探针:一种含AP位点和Alexa Fluor488（AF488）修饰,用于检测hOGG1;另一种含AP位点和cyanine5（Cy5）修饰,用于检测UDG。当hOGG1和UDG同时存在时,可以引发碱基切除修复反应,导致检测探针释放相应的触发探针。释放的触发探针可以分别与相应的信号探针杂交,启动Endo IV介导的信号探针循环裂解。经磁分离,释放到上清液中的荧光分子可以通过单分子检测准确定量,AF488荧光信号用于表征hOGG1,Cy5荧光信号用于表征UDG。该方法的灵敏度非常高,对hOGG1的检出限低至1.892×10-5 U/mL,对UDG的检出限低至1.736×10-5 U/mL,可以在单细胞水平上检测多种DNA糖基化酶。该方法可用于同时测量酶动力学参数和筛选hOGG1和UDG的抑制剂,在生物医学研究和临床诊断中具有潜在应用价值。（四）发展了基于滚环扩增编码多种荧光分子的方法,可以在单分子水平同时检测hAAG和UDG。我们设计了一种双功能dsDNA底物,一条链中的次黄嘌呤碱基（I）用于hAAG识别,另一条链中的尿嘧啶碱基（U）用于UDG识别。dsDNA底物被APE1切割产生两个相应的引物,所得的两个引物可分别与它们各自的环状模板杂交,启动滚环扩增反应,将多个Cy3-dCTP和Cy5-dGTP嵌入扩增产物。经磁分离和核酸外切酶切割后,扩增产物中的Cy3和Cy5荧光分子释放到溶液中,可用单分子检测进行定量分析。Cy3荧光信号用于表征hAAG,Cy5荧光信号用于表征UDG。该方法通过引入RCA驱动的不同荧光分子编码,显著增加每个串联分子中的荧光分子数,无需引入专门标记的检测探针即可实现同时检测,极大简化了实验步骤,提高了灵敏度。该方法可以在单细胞水平上同时检测癌细胞中的多种DNA糖基化酶,并有效区分正常细胞与癌细胞。该方法可进一步应用于酶动力学参数分析和DNA糖基化酶抑制剂的筛选,在生物医学研究、临床诊断和药物研发中具有广阔应用前景。