论文部分内容阅读
目的:舌鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma of tongue,TSCC)是最常见的头颈部恶性肿瘤之一。尽管近几十年来针对舌癌的外科手术和放化疗等治疗手段不断完善,其5年生存率并没有明显提高,因此探讨舌鳞状细胞癌生长、发展的分子机制尤为重要。Rac1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)作为Rho GTPase家族中的重要一员,被证实在调控肿瘤的增殖、运动及凋亡等生物学行为上起重要作用,已成为恶性肿瘤分子靶向治疗的研究热点。目前研究多集中于Rac1与胃癌、乳腺癌、结肠癌等部位肿瘤的相关性,而其对舌癌生长发展的影响研究较少。本研究通过构建小分子干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)沉默Rac1基因,探讨RAC1对舌鳞状细胞癌增殖、侵袭和迁移的影响及分子机制。方法:登录Genebank确定人Rac1的基因序列,设计并合成3条Rac1的siRNA序列,并分别将3条siRNA通过脂质体介导方式转染至3组舌癌细胞CAL27中。同时设立阴性对照组(NC-siRNA,转染无关核苷酸序列)和空白对照组(只加转染试剂,不加siRNA)。1.采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测转染48h后各组CAL27细胞中Rac1 mRNA的表达情况。2.通过蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测转染48h后各组CAL27细胞中Rac1、PAK1、LIMK1、Cyclin D1、p21和p27蛋白表达的变化,利用Image J软件分析胶片灰度值。3.利用CCK-8增殖实验和流式细胞术检测转染48h后CAL27细胞的增殖活性和细胞周期变化。4.通过划痕实验及Transwell细胞侵袭实验检测转染后48h后CAL27细胞迁移和侵袭能力变化。采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计和分析。数据的两组间比较采用t检验,多样本均数间比较采用单因素方差分析,设P<0.05有统计学意义。结果:1.实时荧光定量PCR实验检测结果显示,细胞转染48h后,与阴性对照组和空白对照组相比,3组Rac1 siRNA细胞中Rac1 mRNA和蛋白的表达均下降,差异有统计学意义(P<0.05)。2.Western blot检测结果显示,与阴性对照组、空白对照组相比,实验组的Rac1、PAK1、LIMK1、Cyclin D1蛋白的表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);p21、p27蛋白的表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3.CCK-8法对细胞活力检测结果表明,与空白对照组和阴性对照组相比,转染48h后siRNA组细胞增殖活性均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4.细胞划痕试验结果显示,实验组CAL27细胞划痕愈合缓慢,而阴性对照组和空白对照组划痕已基本长满,差异有统计学意义(P<0.05)。5.Transwell细胞侵袭实验表明,阴性对照组和空白组穿过滤膜的细胞数量较多,Rac1-siRNA组穿膜细胞数显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论及意义:特异性沉默Rac1基因可抑制舌鳞癌细胞CAL27中Rac1的表达,从而降低细胞的增殖能力,其机制可能与Cyclin D1表达上调,p21、p27表达下调有关;沉默Rac1可抑制舌癌细胞CAL27的迁移和侵袭,其机制可能与细胞内PAK1、LIMK1表达下调有关。提示Rac1可能成为治疗舌癌的有效靶点。