背景:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率占全身各种恶性肿瘤的7%~10%,每年全世界约有140万人被诊断为乳腺癌,而大约有50万人死于该疾病,严重威胁着女性的健康。乳腺癌发病可能与内分泌、生育因素、饮食、辐射及遗传等因素有关,但原因尚不完全清楚。肠道微生物受遗传因素、生活方式、环境等因素影响,参与人体的基本生理活动,在维持肠道正常结构和生理功能、参与肠道物质代谢、拮抗病原微生物定殖、调节人体免疫功能等方面发挥了重要作用,大量研究表明人体肠道微生物与肥胖、糖尿病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、新生儿坏死性小肠结肠炎、癌症等疾病密切相关。越来越多的证据表明,肠道微生物与乳腺癌有关,其机制可能是通过雌激素代谢,饮食,免疫调节,抗生素,酒精,炎症反应等因素参与。目前关于肠道微生物与乳腺癌的研究仅局限于肠道微生物结构,缺乏肠道微生物功能的研究。对肠道微生物的认识,主要取决于研究技术,传统微生物学以及微生物基因组学都是以可培养的微生物克隆产物为基础的,但肠道菌群中90%以上的细菌是无法培养的,培养法研究用于肠道微生物的多样性会有严重偏差;尽管16S r RNA基因测序分析能进行物种分类和丰度分析,研究肠道微生物的结构,但不能全面、系统的研究微生物的代谢功能,随着基因组学的快速发展,肠道微生物的研究已经进入宏基因组学研究时代,借助高通量测序技术让我们能更系统、全面的研究乳腺癌患者肠道微生物的结构和功能。目的:本研究借助二代测序技术,首次利用宏基因组学的方法全面系统分析乳腺癌患者肠道微生物结构变化及功能代谢变化。观察乳腺癌患者是否存在菌群失调,鉴定与乳腺癌患者相关的菌群,并从菌群的功能基因层面研究与乳腺癌发生的相关性,揭示了肠道菌群在乳腺癌发生发展中的作用;从肠道微生物的层面,为进一步研究乳腺癌的发病机制提供前期的研究基础,并有助于预测和评价宿主患有乳腺癌的风险和研发新的乳腺癌诊断方法、治疗方式。方法:选取18例绝经前乳腺癌患者,25例绝经前健康志愿者,44例绝经后乳腺癌患者,46例绝经后健康志愿者(共四组研究对象)的粪便作为研究样品;病例组要求患者病理诊断为乳腺癌;所有研究对象无腹泻、炎症性肠病(IBD),肠易激综合征(IBS),肥胖,糖尿病,类风湿性关节炎,肝硬化,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD),心血管系统疾病,精神性疾病,结直肠肿瘤等疾病,无其它感染性疾病。乳腺癌患者和健康对照志愿者在留取粪便样品的前三月未服用抗生素、类固醇等激素、中草药制剂(包括口服,肌肉注射或静脉注射),未服用微生态制剂或酸奶等益生菌;并且,乳腺癌患者未使用过环磷酰胺、蒽环类、紫杉醇类等化疗药物。提取乳腺癌患者和健康对照志愿者的肠道微生物宏基因组DNA,进行Hi Seq X10(Illumina)高通量测序和生物信息分析,运用BWA软件将测序获得的宏基因组reads与人的肠道基因集数据库进行比对、注释,对注释的物种进行差异分析;运用BWA软件进行KEGG代谢通路的注释并进行差异分析。并将显著差异的细菌、代谢通路与临床表型进行相关性分析。结果:1.在四组研究对象肠道菌群结构总体比较分析中,在门水平上,四组研究对象肠道内Proteobacteria(变形菌门)有显著差异。在属水平上,四组研究对象肠道内Acidaminococcus(氨基酸球菌属),Acinetobacter(不动细菌属),Actinomyces(放线菌属),Citrobacter(柠檬酸细菌属),Epulopiscium,Erwinia(欧文氏菌属),Escherichia(埃希氏菌属),Klebsiella(克雷伯氏杆菌属),Peptoniphilus,Proteus(变形菌属),Providencia(普罗威登斯菌属),Rothia(罗思氏菌属),Salmonella(沙门氏菌属),Shigella(志贺氏菌属),Sodalis,Variovorax,Vibrio(弧菌属),Yersinia(耶尔森氏菌属)有显著差异。2.在四组研究对象肠道菌群功能代谢总体比较分析中,四组研究对象肠道菌群的功能代谢有显著差异,包括:氨基酸的转运,维生素转运,毒性产物转运、代谢,氧化代谢,与细菌有关的信号转导机制、复制功能等。3.在乳腺癌和健康对照肠道菌群结构比较分析中,在门水平上,绝经前乳腺癌患者与绝经前健康对照肠道菌群无显著差异;与绝经后健康对照相比,绝经后乳腺癌患者肠道内的Fusobacteria(梭杆菌门),Proteobacteria(变形菌门),Synergistetes(互养菌门)的丰度明显增加。在属水平上,绝经前乳腺癌患者和绝经前健康对照肠道菌群无显著差异;与绝经后健康对照相比,绝经后乳腺癌患者肠道内的Escherichia(埃希氏菌属),Shigella(志贺氏菌属),Proteus(变形菌属),Vibrio(弧菌属),Acinetobacter(不动细菌属),Providencia(普罗威登斯菌),Salmonella(沙门氏菌属),Sodalis,Citrobacter(柠檬酸细菌属),Thiomicrospira(硫微螺菌属),Variovorax(贪噬菌属),Peptoniphilus,Pseudomonas(假单胞菌属),Erwinia(欧文氏菌属),Yersinia(耶尔森氏菌属),Actinobacillus(放线杆菌属),Bulleidi的丰度明显增加,Actinomyces(放线菌属)的丰度明显减少。4.在乳腺癌和健康对照肠道菌群功能代谢比较分析中,与绝经前健康对照相比,绝经前乳腺癌患者肠道微生物功能代谢发生明显改变,与氨基酸代谢有关的细菌丰度明显增加,与复制功能有关的细菌丰度明显减少;与绝经后健康对照相比,绝经后乳腺癌患者肠道微生物功能代谢发生明显改变,与维生素转运,毒性产物转运、代谢,细菌信号转导机制、复制、重组、修复等功能有关的细菌丰度明显增加。5.乳腺癌和健康对照肠道差异菌群与临床表型的相关性分析中,绝经后乳腺癌患者和绝经后健康对照肠道差异细菌:Pseudomon(假单胞菌属)与CD3+CD4+/CD3+CD8+(Th/Ts)呈正相关关系,而与体液免疫、雌二醇(E2)无显著相关性。6.在乳腺癌和健康对照肠道菌群差异KEGG代谢通路(map)与临床表型的相关性分析中,绝经后乳腺癌患者和绝经后健康对照肠道菌群差异代谢通路(map)与细胞免疫、雌二醇(E2)无显著相关性,与体液免疫有显著相关性。7.在乳腺癌和健康对照肠道菌群差异KEGG功能单元模块(module)与临床表型的相关性分析中,绝经前乳腺癌患者和绝经前健康对照肠道菌群差异功能单元模块(module)与细胞免疫、体液免疫有显著相关性,与雌二醇(E2)无显著相关性;绝经后乳腺癌患者和绝经后健康对照肠道菌群差异功能单元模块(module)与细胞免疫、雌二醇(E2)无显著相关性,与体液免疫有显著相关性。结论:乳腺癌患者肠道菌群结构及功能结构均发生显著变化,并且乳腺癌患者肠道菌群与体液免疫、细胞免疫有关;本研究对乳腺癌患者肠道微生态失衡进行了从结构到功能的全面分析,深入揭示了肠道菌群在乳腺癌发生发展中的作用;结果提示肠道菌群结构及功能结构变化可以作为监测宿主健康状态的生物学指标,预测和评价宿主患有乳腺癌的风险;并且,可以为临床通过肠道菌群诊断和治疗乳腺癌提供理论依据。