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研究目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是严重危害人类健康的疾病,其发展缓慢并伴随着脂质斑块在大中型动脉血管中的沉积,如果斑块破裂或被侵蚀就会形成血栓,堵塞血管造成缺血性组织损伤。多种学说从不同的角度解释其可能的发病机制,其中基于损伤应答学说提出的“动脉粥样硬化是一种炎症性疾病的炎症免疫反应学说”,已经成为心血管界乃至免疫学界研究的热点。从免疫学方面进一步探讨AS的相关机制,探讨AS发生发展的过程中免疫细胞以及免疫分子所扮演的功能及相互作用,这对于临床采用免疫干预手段防治AS具有重要的意义。TNFAIP2,即肿瘤坏死因子 α 诱导蛋白 2(tumor necrosis factor-α-induced protein-2),又称B94或M-sec,其最早发现是TNF-α刺激内皮细胞后表达的主要基因。随后又有研究表明炎症因子IL-1或脂多糖刺激后均可诱导TNFAIP2的表达。它是一个高度保守的单拷贝基因,鼠的TNFAIP2的氨基酸序列与人的相比具有83%的同源性。近年来研究发现,TNFAIP2在免疫细胞和膀胱中高度表达,TNFAIP2被多个转录因子和信号通路所调控,包括NF-κB、KLF5和视黄酸。从生理学上讲,TNFAIP2不仅是炎症、血管生成和隧穿纳米管(TNT)形成的多功能介质,而且是细胞增殖和迁移的调节因子。TNFAIP2的表达在人类癌症和感染性疾病中经常是异常的。现如今对TNFAIP2的研究主要在肿瘤性疾病方面,而对于其在炎症性疾病中的作用研究并不多。而且对于TNFAIP2在生理和病理条件下的作用还远不清楚。TNFAIP2的翻译后修饰、相互作用蛋白、转录调控和下游功能机制,以及TNFAIP2能否发展成为诊断和治疗靶点还有待进一步研究。为了进一步明确TNFAIP2在炎症性疾病中的作用,我们以慢性炎症性疾病——动脉粥样硬化为模型,探究TNFAIP2在动脉粥样硬化的发生发展中是否发挥作用,以及相关作用机制如何。本课题从体内实验和体外实验系统化的研究TNFAIP2在动脉粥样硬化形成过程中的功能,并初步探讨了相关分子机制,证明了 TNFAIP2除了参与肿瘤的发生外,还可以通过炎症反应机制促进动脉粥样硬化形成。TNFAIP2通过免疫学机制促进动脉粥样硬化形成,有利于揭示血管区域免疫紊乱在AS发生中的分子机制。筛选干扰TNFAIP2基因表达防治动脉粥样斑块形成的可行性方案的研究结果,有望为临床有效防治AS的发生发展及以AS为病理基础的心脑血管疾病的免疫干预提供新的靶点。研究方法1.动物实验研究TNFAIP2对体内斑块形成的影响以10-12周ApoE-/-小鼠进行颈动脉套管,颈动脉套管3天后每组分别尾静脉注射shControl和shTNFAIP2重组慢病毒,制备了TNFAIP2表达降低的动脉粥样硬化小鼠模型,高脂喂养8周后取小鼠血液检测血清中相关细胞因子IL-6、TNF-α、IL-12以及血糖血脂水平,分离获得心脏及腹主动脉等材料,大体油红0染色观察斑块形成情况;主动脉根部血管甲醛固定、OCT包埋后制备连续切片,通过HE、油红0染色、免疫组化等方法,统计斑块面积,鉴定斑块的成分及性质,综合分析TNFAIP2促进斑块形成的作用。2.细胞实验研究TNFAIP2对巨噬细胞功能的影响在明确TNFAIP2具有促动脉粥样硬化形成的基础上,以在动脉粥样硬化形成中发挥重要作用的巨噬细胞为靶细胞,进一步深入研究TNFAIP2是否通过调控巨噬细胞功能发挥促动脉粥样硬化形成效应。2.1 H2O2对巨噬细胞表达TNFAIP2的影响不同浓度的H2O2或同一浓度下H2O2作用不同的时间来刺激巨噬细胞系RAW264.7和原代腹腔巨噬细胞,采用Wstern blot方法检测TNFAIP2的表达水平。2.2分析TNFAIP2对细胞生长和凋亡的作用分离培养TNFAIP2-/-小鼠与野生型小鼠的原代腹腔巨噬细胞或采用293T细胞以及巨噬细胞系RAW264.7,以H2O2作用一定时间后,以不加H2O2的细胞为对照,收集细胞,进行检测。2.2.1采用CCK-8的方法检测TNFAIP2对巨噬细胞活性的影响采用TNFAIP2的小干扰转染巨噬细胞系RAW264.7使TNFAIP2被干扰,以H202作用一定时间后,采用细胞活性检测试剂盒CCK-8分析TNFAIP2对巨噬细胞活性的影响。2.2.2采用克隆形成的方法检测TNFAIP2对巨噬细胞增殖的影响采用TNFAIP2的小干扰转染巨噬细胞系RAW264.7使TNFAIP2被干扰,以H202作用下培养一定时间后,用结晶紫染色记录单克隆数以分析TNFAIP2对巨噬细胞增殖的影响。2.2.3采用流式细胞术检测TNFAIP2对巨噬细胞周期分布的影响采用TNFAIP2的小干扰转染巨噬细胞系RAW264.7使TNFAIP2被干扰或采用TNFAIP2表达质粒转染293T获得TNFAIP2过表达,H202作用一定时间后,采用流式细胞术分析TNFAIP2对细胞周期分布的影响。2.2.4采用流式细胞术检测TNFAIP2对巨噬细胞凋亡的影响分离培养TNFAIP2/-小鼠与野生型小鼠的原代腹腔巨噬细胞,或采用TNFAIP2表达质粒转染293T获得TNFAIP2过表达,以H202作用一定时间后,一方面采用Annexin V/PI染色,并用流式细胞术检测分析TNFAIP2对细胞凋亡的影响,另一方面提取蛋白通过Western blot检测Caspase-3活化及Bc1-2、Bax等凋亡相关蛋白表达情况。2.3研究TNFAIP2对巨噬细胞应激时产生趋化因子的影响分离培养TNFAIP2/-小鼠与野生型小鼠的原代腹腔巨噬细胞,H2O2作用一定时间后,提取细胞DNA,通过Real-time PCR检测MCP-1细胞因子的情况。2.4分析TNFAIP2对巨噬细胞迁移的影响采用TNFAIP2的小干扰转染巨噬细胞系RAW264.7干扰TNFAIP2表达,在H2O2的作用下进行划痕实验,进而分析TNFAIP2对巨噬细胞的迁移的影响。2.5分析TNFAIP2对巨噬细胞吞噬功能的影响分离培养TNFAIP2/-、小鼠与野生型小鼠的原代腹腔巨噬细胞,培养过程中加入oxLDL,通过油红0染色检测吞噬脂质情况,Real-time PCR检测细胞的清道夫受体如CD36、SR-A等表达水平。3.研究TNFAIP2调控巨噬细胞功能的分子机制在明确TNFAIP2能够通过调控巨噬细胞功能发挥抗动脉粥样硬化形成效应的基础上,研究TNFAIP2调控巨噬细胞功能的胞内信号通路及关键分子:以H2O2作用于TNFAIP2+/-小鼠与野生型小鼠的原代腹腔巨噬细胞,Western blot检测细胞NF-κB(调控炎症因子表达)、MAPK(ERK、JNK,调控细胞生长)、PI3K-Atk(调控细胞死亡)等信号通路的活化,分析信号通路上的关键分子的变化。研究结果1.干扰TNFAIP2表达可抑制动脉粥样硬化斑块形成为探讨TNFAIP2是否在AS的发生中发挥作用,明确其是抗动脉粥样硬化的新基因还是促进动脉粥样硬化的发生,经尾静脉注射shTNFAIP2病毒以及shcontrol并高脂喂养后取主动脉根部斑块进行HE和油红0染色及主动脉大体油红0染色,结果均显示注射shTNFAIP2组的斑块面积显著低于对照组,说明TNFAIP2可促进动脉粥样硬化形成。ELISA检测注射shTNFAIP2组小鼠血清中的IL-6、TNF-α等炎症因子水平较对照组显著降低,血清总胆固醇(CHO)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TRIGL)显著低于对照组。主动脉根部斑块免疫荧光染色结果分析得注射shTNFAIP2组小鼠斑块中的巨噬细胞与对照组相比较明显减少。2.H2O2刺激巨噬细胞上调TNFAIP2的表达结合动物实验,同时考虑到巨噬细胞在致AS发生中的重要作用,以巨噬细胞(RAW264.7)为靶细胞,以H2O2刺激细胞检测了巨噬细胞在炎症或氧化应激时的TNFAIP2表达的变化,结果显示H2O2均能够显著上调TNFAIP2的蛋白质水平,呈现时间依赖性和剂量依赖性,说明在AS发生时TNFAIP2水平升高。3.TNFAIP2对巨噬细胞的生长具有一定的调控作用以巨噬细胞(RAW264.7)为靶细胞,干扰TNFAIP2的表达水平,再以H2O2刺激细胞,通过CCK8检测了巨噬细胞活性,结果显示干扰TNFAIP2的巨噬细胞活性明显低于对照组。以293T为靶细胞,转染TNFAIP2质粒过表达,再以H2O2刺激,检测结果发现过表达TNFAIP2的细胞活性明显高于对照组。同时,干扰巨噬细胞(RAW264.7)的TNFAIP2的表达水平,以H2O2刺激细胞后,克隆形成也明显低于对照组。在293T中过表达TNFAIP2后可减少G0/G1期的细胞比例,增加S和G2/M期的细胞比例,表明TNFAIP2促进细胞周期进程。4.TNFAIP2对巨噬细胞的凋亡具有一定的调控作用以H2O2作用于分离得到的TNFAIP2/-小鼠与野生型小鼠的原代腹腔巨噬细胞,以Annexin V/PI染色流式细胞术检测分析细胞凋亡率,结果发现TNFAIP2缺陷后细胞凋亡率增加。而通过293T使TNFAIP2过表达的结果显示其凋亡水平低于对照组。另一方面提取蛋白通过Western blot检测发现TNFAIP2缺陷使Caspase-3活化及Bax水平增加,Bc1-2水平减少。5.TNFAIP2对巨噬细胞应激时产生趋化因子的影响以H202作用于原代腹腔巨噬细胞,实时定量PCR检测MCP-1基因的表达,结果显示TNFAIP2基因缺陷后MCP-1基因的表达明显下调。6.TNFAIP2基因的缺陷会影响巨噬细胞的迁移水平以H2O2作用于干扰TNFAIP2基因的巨噬细胞系RAW264.7,划痕实验结果显示干扰TNFAIP2基因后细胞与对照组相比迁移水平降低。7.TNFAIP2基因的缺陷对巨噬细胞的吞噬功能有一定的影响以oxLDL刺激TNFAIP2/-小鼠与野生型小鼠的原代腹腔巨噬细胞,通过油红0染色结果显示,TNFAIP2基因的缺失对巨噬细胞的吞噬功能有上调作用,同时吞噬白色念珠菌实验结果也显示同样趋势。Real-time PCR检测细胞的CD36、SR-A、SR-BI、ABCA1基因水平,结果显示TNFAIP2缺失后CD36、SR-A、SR-BI基因表达水平上调,而ABCA1基因的表达水平下调。8.TNFAIP2可调控巨噬细胞的NF-κB和MAPK信号通路以H2O2作用于TNFAIP2/-小鼠与野生型小鼠的原代腹腔巨噬细胞,分别于不同的时间点收集细胞,Western blot检测细胞NF-κB和MAPK信号通路上的关键分子,结果显示与对照组相比,TNFAIP2基因缺陷后Iκ-B、P38、ERK的磷酸化水平显著降低,而JNK的磷酸化水平变化不是很明显。结论1.动物实验证实TNFAIP2具有促进动脉粥样硬化形成作用。2.TNFAIP2可通过调控巨噬细胞的增殖、凋亡、迁移、吞噬功能发挥促AS的效应。3.TNFAIP2促AS的效应与调控巨噬细胞的NF-κ B和MAPK信号通路的活化有关。创新点及意义1.率先研究TNFAIP2在动脉粥样硬化发生中的作用及机制,是本课题最显著的创新点。2.证明TNFAIP2除了参与肿瘤的发生外,还可以通过炎症反应机制促进动脉粥样硬化形成。3.TNFAIP2促进动脉粥样硬化形成,不仅有利于揭示冠心病AS斑块发生的机制,而且筛选干扰TNFAIP2基因表达防治动脉粥样斑块形成的可行性方案研究结果为发现有效防治冠心病的新靶点和新途径奠定基础。