在人类基因组中，蛋白编码基因只占1.5％左右，最近的研究表明人基因组70％都被转录成RNA，其中包含约近万种长链非编码RNA(long non-codingRNAs，lncRNAs)[1]。lncRNAs是一组不编码蛋白质，长度大于200个核苷酸的转录体，研究表明，lncRNA在细胞周期和分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，其表达具有高度的组织特异性并参与调控肿瘤发生发展的各个环节，包括持续增殖信号，逃避生长抑制，永生化，激活侵袭和转移能力，诱导血管生成及抵抗细胞死亡等[2]，基于以上肿瘤标志，lncRNAs被列为肿瘤靶向治疗的新型靶点，正成为肿瘤研究的新热点。长链非编码RNA功能的发挥通常依赖于相互作用蛋白，如众所周知的lncRNA7SK就是通过与转录因子P-TEFb的相互作用，调控细胞生长相关基因的表达，从而发挥对细胞功能的调控作用[2]。lncRNA MEG3(MaternallyExpressed Gene3)是一种母系遗传的印记基因，位于人类染色体14q32，在多种肿瘤组织及肿瘤细胞系中表达显著降低，影响肿瘤发展的进程。在癌细胞系如MCF7，HeLa, H4和CH157-MN中重新表达MEG3，可以抑制细胞增长，而这一生物学效应依赖于P53通路，即通过提高P53的蛋白水平，有效促进依赖于P53的转录激活功能，并选择性上调部分P53靶基因的表达[3]。然而调控MEG3参与P53抑癌通路的关键蛋白，至今未有详细报道。因此，纯化与MEG3相互作用的蛋白，并确定直接介导的关键蛋白成为了进一步探讨MEG3在乳腺癌发生发展中调控机制的首要问题。　　目的:1.建立lncRNAs胞内结合蛋白的亲和纯化体系，并优化纯化条件。2.利用最终优化条件后的方法纯化与MEG3结合的蛋白。3.检测稳定过表达MEG3对细胞增殖、迁移等生物学功能的影响。　　方法:1.载体构建，即将MS2发夹序列克隆入pcDNA5/FRT/TO载体中，再利用分子克隆技术，从肺成纤维细胞cDNA中克隆MEG3，并克隆入改造后的表达载体中发夹序列上游(MEG3)，同时将插入MEG3反向序列的载体(MEG3-AS)及仅插入MS2发夹序列的空载体(MS2)作为对照。2.将上述各表达质粒瞬时转染到Hela中，通过RT-PCR（逆转录-聚合酶链反应）验证目的基因的完整性，并通过RNA荧光原位杂交进行胞内定位。3.利用Flp-In定点稳转技术构建MEG3、MEG3-AS及MS2的可诱导稳转细胞株。4.纯化MS2-MBP蛋白，即IPTG诱导后，大肠杆菌中表达MS2-MBP蛋白，摇瓶培养，离心收集菌体，超声破碎后，首先通过直链淀粉(Amylose)亲和层析柱纯化，进而通过肝素柱纯化去除残留核酸[4]。5通过核质分离技术制备诱导后稳定表达目的基因的细胞核提取物[5]。6.利用MS2-MBP蛋白的MS2部分与转录产物上的发夹序列的特异性结合以及MBP与Amylose的亲和力，将偶联有MS2-MBP的Amylose树脂与稳定表达目的RNA的细胞核提取物在一定条件下孵育，纯化结合于MEG3上的蛋白复合物。7.利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过银染鉴定。　　结果:首先成功克隆到了MEG3，验证了其定位于细胞核中，并构建了MEG3、MEG3-AS及MS2稳定表达的细胞系，经强力霉素(DOX)诱导后，基因稳定表达。功能性实验表明，过表达MEG3，能够显著抑制细胞迁移，但对细胞增殖无显著影响。同时制备了一批MS2-MBP蛋白，其纯度大于95％。初步建立了胞内lncRNP亲和纯化方法，并将最终条件优化为:将偶联了MS2-MBP的微珠与稳转表达MEG3、MEG3-AS及MS2的细胞核提取物4℃孵育3h，洗脱液中KCl浓度为250mM，洗脱5次，每次3min。并验证了在收集细胞前，增加紫外交联这一步，可以固定RNA与蛋白间的相互作用，使结果更稳定。　　结论:本研究结果表明已初步建立了适用于长链非编码RNA胞内结合蛋白的纯化方法。