1．真核基因转录调控的协同性 在真核生物的生长发育以及在对外界刺激信号做出反应的过程中，涉及到上万个基因在特定的时间和空间上进行特异性的表达。基因的表达需要在多种水平进行精确的调控，而转录水平的调控具有非常重要的意义。基因转录的调控由转录因子介导，它们能够与启动子上的特异性位点结合，招募转录机器组分结合到启动子上，从而激活基因的转录。基因特异性的表达依赖于一套特定的转录调节因子与DNA调控元件之间的相互作用，各种因子之间的协同性作用是实现基因特异性表达所采取的有效策略。 关于转录协同性产生的机制存在两种讨论较多的观点：一种观点认为多个转录激活因子在结合DNA的时候具有协同性，因而导致转录的协同效应；第二种观点认为，结合在DNA上的多个转录激活因子分别与转录机器组分相互作用，这种多重相互作用产生了转录的协同性。为了弄清哪一种是较为普遍的机理，我们使用两个不仅在分子结构上相差较远，在生物功能上也不相关的转录激活因子ZEBRA和GAL4-VPl6为模型来研究协同性产生的机制。我们在大肠杆菌中成功表达并纯化了具有生物功能的这两种蛋白质。EMSA分析表明，在含有ZEBRA结合位点ZⅢB和GAL4结合位点的DNA片段上，ZEBRA和GAL4-VPl6的结合不具有协同性，这表现在两个方面：在热力学水平，预先结合的GAL4-VPl6对ZEBRA与DNA的结合常数没有影响；在动力学水平，先结合的GAL4-VPl6也没有促进ZEBRA更快的结合。在293T细胞中进行的转录实验表明，不仅多个ZEBRA结合位点之间表现出了强烈的协同性特征，多个GAL4位点之间、ZEBRA结合位点ZⅢB与GAL4位点之间也都存在强烈的协同性。根据这些实验结果，我们认为，转录激活因子与转录机器组分之间形成的多重协同性相互作`用应该是产生真核基因转录协同性的更为普遍的机理。 分布在基因组序列中的转录调控元件决定了基因的表达水平和特异性，这些顺式调控元件在生物多样性的进化中具有重要意义，甚至被称为基因组的第二密码。在基因调控时，多个激活因子的结合位点常常组合在一起，协同性地调控基因的转录水平，这种转录因子结合位点的组合称为顺式调控模块（cis-regulatory module）。近来，已经通过计算和统计的方法研究成对出现的转录激活因子结合位点，预测基因的表达。我们通过实验的方法研究了顺式调控模块中，激活因子结合位点各种组合模式对转录水平以及转录协同性的影响。以半个螺旋为周期，增加两个ZEBRA结合位点ZⅢB之间的距离，考察了两个结合位点之间距离和位点之间相对相位变化对转录强度的影响。结果表明，随着结合位点之间距离的增加，两个位点组合激活转录的水平迅速降低，下降的过程呈现出鲜明的指数特征。并且，激活转录的强度没有表现出对两个结合位点相位的依赖性。我们还系统的增加了ZEBRA结合位点．ZⅢA和ZⅢB之间、ZⅢB和GAL4结合位点之间的距离来观察激活转录的水平，得到了类似的结果。因此我们认为，在多个激活因子形成的组合中，距离是决定转录强度的最为关键的因素。 为了研究结合位点组合中方向对转录强度的影响，我们系统地改变了两个ZⅢB位点形成的组合中一个或者两个位点的方向，结果表明，结合位点方向对两个结合位点激活的转录没有很大的影响，在对ZⅢB和ZⅢA形成的组合进行分析时，也得到了类似的结果。然而，对于两个不同激活因子的结合位点形成的组合，改变结合位点的方向对转录水平产生了较大的影响。当激活结构域富含甘氨酸／脯氨酸／谷氨酰胺的ZEBRA位于近启动子位置时拥有最大的转录强度和转录协同性，当酸性激活因子GAL4-VPl6位于近启动子端时，转录强度变为原来的七分之一，转录协同性也大大降低。因此我们认为，对于同种转录激活因子结合位点，改变结合位点的方向以及它们的相对位置对转录水平和协同性影响较小，而对于两种不同的转录激活因子，尤其是这两种激活因子具有不同的结构组成和转录激活能力时，两个结合位点之间的相对位置和方向对转录水平和协同性则有较大的影响。 2．两种ZZ荧光融合蛋白在免疫分析中的应用 目前，在免疫分析中使用的带有检测标记的第二抗体，通常都是将纯化的抗体与荧光分子或者碱性磷酸酶分子通过化学偶联的方法交联到一起。其中，抗体主要还是从动物中制备，并且针对不同生物来源的一抗，要制备相对应的第二抗体。在对抗体分离纯化之后才能将其与荧光分子或者酶分子进行偶联。这种传统的方法不仅耗费时间长，成本也比较高，并且化学偶联可能造成抗体或者酶活性的丧失。Z结构域由58个氨基酸组成，是一个根据金黄色葡萄球菌蛋白A的B结构域人工合成的一个IgG抗体Fc片段结合蛋白。绿色荧光蛋白（EGFP）是一种从维多利亚水母中克隆得到的荧光蛋白质。红色荧光蛋白（DsRed）是在寻找GFP同源蛋白的时候在珊瑚虫中发现的。自从发现以来，这两种荧光蛋白都经过多次基因改造，形成了具有更好荧光特性、可溶性的EGFP和DsRed-Express。在这里，我们将这两种荧光蛋白与ZZ蛋白融合表达，成功构建了两种可以和抗体结合的融合蛋白ZZ-EGFP和ZZ-DsRed。融合蛋白在大肠杆菌中得到了高效的表达，并通过Ni柱亲和层析使蛋白得到分离纯化。两种融合蛋白都具有很好的荧光活性和抗体结合活性。在Western印迹杂交和点杂交检测抗原的研究中，作为荧光标记的二抗，ZZ-EGFP和ZZ-DsRed都能有效的检测到目的蛋白质。具有和传统的HRP检测系统相似的灵敏度。在蛋白质的免疫荧光分析中，ZZ-EGFP和ZZ-DsRed都能够特异性的与抗体结合，实现对抗原蛋白的定位，具有和FITC标记二抗相当的灵敏度和检测效率。与传统的荧光标记或者HRP标记抗体相比，ZZ-EGFP和ZZ-DsRed制备操作非常简单不需要进行化学偶联，需要的时间短，消耗的成本比较少，并且两种融合蛋白都具有较强的抵抗光淬灭的能力。因此我们相信，这两种荧光融合蛋白在免疫荧光分析领域具有很好的应用前景。