【研究背景】支气管哮喘(哮喘)是一个严重危害人类健康的疾病，目前尚缺少有效的防治方法。哮喘的发病机制复杂，涉及多种效应细胞及其分泌的炎症介质。气道上皮细胞就是其中具有重要作用的效应细胞之一，它位于外界刺激与机体内环境接触的第一环节，在哮喘中处于持续损伤与异常修复的状态，能够分泌多种炎症介质，影响周围组织及炎性细胞的结构与功能，被认为是哮喘发生的始动部位之一。近年的研究表明，上皮中杯状细胞特有的一种钙激活Cl~-通道(CLCA)是上皮杯状细胞参与哮喘发生的主要功能单位，阻断CLCA是防治哮喘具有潜在前景的措施。这种功能独特的CLCA已知基因序列有：人hCLCA1、小鼠mCLCA3。以CLCA为作用靶位的哮喘防治疫苗尚无研究。 【目的】1、利用hCLCA1和mCLCA3的异种同源性，构建人源hCLCA1 DNA疫苗，肌注法接种给小鼠，试图突破小鼠自我的免疫耐受屏障，诱导其产生针对自身mCLCA3胞外肽段的交叉抗体，以期达到阻断气道mCLCA3通透活性、防治哮喘发生的目的。2、利用小鼠在体哮喘模型、杯状细胞体外培养细胞模型，初步探讨该疫苗防治哮喘效应的机制。 【方法】1、将测序鉴定正确的hCLCA1基因亚克隆入分泌型真核表达载体pSecTag2-B，将重组质粒pSecTag2-B／hCLCA1肌注法分次接种给BALB／c小鼠，留取血清，并观察小鼠的生命体征。PCR法扩增mCLCA3的N端、中间和C端三个胞外肽段(ED)基因，构建pRSET-A／N-ED、第四军医大学博士学位论文pRSET-AjC一ED和pGEX一4T-l舰一ED重组质粒，并在E.coli BLZI(DE3)细胞中表达与纯化三个ED。采用EuSA和Westem blotting法检测免疫血清抗体对ED的亲合力。2、对DNA疫苗组小鼠制备OVA致敏哮喘模型，检测气道压力峰值一时间指数(APTI)、支气管/肺泡灌洗液 (BALF)中炎性细胞数量，PAS特染观察小支气管杯状细胞数量及Rl斗PCR法检测肺组织中粘蛋白MUCSAC mRNA水平，免疫组化和RT.PCR法检测GM一CSF的蛋白与mRNA水平。设立空载体组、哮喘组和正常组为对照。3、建立稳定表达hCLCAI的NCI一H292/h CLCAI细胞系，观察细胞的生物活性，以及受到正常组小鼠血清、DNA疫苗组小鼠血清干预时MUCSAC、GM一CSF的蛋白和mRNA水平。【结果】一、hCLCAI DNA疫苗的构建及其免疫学特性的研究结果1.将获蹭的peDNA3 .1(+)爪CLCAI和peDNA3.l。)/mCLCA3质粒进行酶切和测序鉴定，结果显示hCLCAI和mCLCA3基因分别与GeneBank中登录的N0.AF039400和NO.NM一017474一致。成功构建p跳叮认酥一B爪CLCAI重组质粒后，肌注法接种小鼠并留取不同时间点免疫血清。2.扩增出mCLCA3的三个ED基因并在原核细胞表达。SDS一队GE检测结果显示，Mr xl护为25 .21、 33.94和29.31的条带分别与6His一N一ED、GST-M‘ED和6His一C一ED对应，其主要以包涵体形式存在，初步纯化。3.定量和定性检测证实免疫血清与mCLCA3三个ED均有着特异的结合特性。其中血清抗体与6His一N一ED和6His一C一ED的结合滴度高于GST.M一D。随着接种时间延长，抗体滴度均呈现出升高趋势。4.接种DNA疫苗小鼠的生活质量良好，队S特染显示肠道的杯状细胞数量与合成粘蛋白功能无明显异常。二、hCLCAI DNA疫苗对小鼠哮喘模型防治作用的研究结果1.与正常组小鼠相比，哮喘组、空载体组和DNA疫苗组小鼠的平均APTI值、BALF中嗜酸性粒细胞数量均明显增高，但是DNA疫苗组明第四军医大学博士学位论文显低于哮喘组与空载体组，后两组之间没有显著差异。2.队S特染显示哮喘组、空载体组小支气管上皮出现大量簇状或散在分布的杯状细胞，并在管腔中出现着色的粘液物质;同时肺组织MUCSAC mRNA水平显著升高。而DNA疫苗组的上述现象均明显减轻。3.DNA疫苗组肺组织的GM一CSF蛋白和mRNA水平均明显低于哮喘组和空载体组。同一部位小支气管切片的PAS和免疫组化染色结果均提示，哮喘上皮杯状细胞能够合成GM一CSF。三、hCLCA 1 DNA疫苗防治哮喘机制的初步研究结果1.构建真核表达质粒pIRESZ一EGFp爪CLC^l并稳定转染Nel一H292细胞，获得稳定表达hCLCAI的NCI一H292/h CLCAI细胞系。采用DNA疫苗组小鼠免疫血清进行Westem bfotting法鉴定。2.超微结构观察、M竹法和细胞周期检测均显示，NCI一H292小CLCAI细胞的增殖及合成活性强于亲本细胞。免疫血清能有效抑制这种活性变化。3.NCI一H292/h CLCAI细胞的MUCSAC、GM一CSF的蛋白与mRNA水平均高于亲本细胞，免疫血清能明显抑制这种升高。 【结论】1.首次证实人源hCLCAI DNA疫苗能够有效诱导小鼠产生可结合自身mCLCA3三个ED的交叉抗体。2.hCLCAI DNA疫苗的生物安全性良好，无毒副作用。3.hCLCAI DNA疫苗在一定程度上抑制了小鼠哮喘模型气道高反应性、气道勃液高分泌等两种主要症状的发生。其机制是通过交叉抗体阻断mCLCA3，从而减轻气道局部嗜酸性粒细胞聚集、降低气道上皮及杯状细胞产生MUCSAC和GM一CSF。