第一部分：LRP5基因与强直性脊柱炎的相关性研究研究背景：强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis, AS)是常见的炎症性风湿疾病,主要累及中轴骨骼,引起特征性的后背炎性疼痛,并最终引起结构和功能的破坏,影响病人的生活质量。AS的发病率是0.3%,通常在病人20到30岁的时候发病,男性好发,男女发病比率大约是2-5：1,目前,并不清楚男性女性的自然发病过程为什么不同。遗传因素促成了AS 90%的遗传易感性,HLA-B27和其他主要组织相容性复合体基因促成了AS50%的发病风险,但最近的研究表明除了B27以外的其他基因也促成了AS的发病机制。Wnt信号通路的作用涵盖了胚胎的发生,肿瘤发生,血液学,干细胞,以至于最近发现的骨生物学。低密度脂蛋白相关受体5(LRP5)作为细胞膜表面的共受体,通过Wnt信号通路发挥自己的生物学功能。本项研究探索LRP5与AS的相关性,基于两种假说。1)LRP5参与了AS病人骨量(BMP)和或骨形成的调节。LRP5的功能缺失性突变和功能获得性突变分别与骨质疏松-假性神经胶质瘤(OPPG)和高骨量(HBM)表型相关。此外,LRP5在普通人群的骨量调节中也发挥着重要的作用。晚期AS病人韧带骨赘的形成,好像增高了骨量的评分,掩盖了病人真实的椎体脱矿。更重要的是,病人的松质骨和皮质骨有着显著的不同：松质骨的骨量降低,导致了AS病人的椎体骨质疏松,并增加了病人的骨折风险,然而,病人的皮质骨的特异性位点开始骨的增殖和肥厚。基于以上观察,可以看出,LRP5调节着骨量,而AS病人不但表现为骨质疏松,也表现为病理性的骨形成。2)LRP5作为炎症/骨化开关。Wnt信号通路在RA的发病机制中发挥着一定的作用。通过诱导骨保护素的表达,Wnt信号通路阻断了破骨细胞的生成。在RA病人的滑膜组织,TNF通过诱导Wnt信号通路抑制子(DKK1蛋白)的表达,干扰了Wnt信号通路的传导。通过诱导DKK1的表达,Wnt信号通路受到抑制,随后导致骨保护素的表达降低。在生理条件下,骨保护素通过连接RANKL,维持着骨吸收与骨形成之间的动态平衡。而在感染性关节炎,这种平衡倾向于RANKL生成的增多。我们假设LRP5在这里起着炎症骨化开关的作用,在AS病人中,不依赖于DKK1而发挥着病理性作用。一方面,LRP5引起骨保护素的增高,抑制破骨细胞的骨吸收,另一方面,LRP5促进了成骨细胞的增殖和分化。研究目的：本研究的目的就是要探讨在中国汉族人群中,LRP5基因与AS的相关性。尤其是检测LRP5基因内或LRP5基因的上游(包括第一外显子上游2000个碱基的启动子区域,外显子区域,外显子和内含子交接区域)是否有突变位点或新的多态位点。研究方法：研究对象：16个没有血缘关系的AS病人(12个男性,平均年龄26.5±5.56岁),研究这些病人的LRP5基因是否存在突变或新的变异。所有的研究对象都来自山东省,汉族人群。根据84年纽约标准,由有医师资格的风湿科医生,对患者进行体格检查及病史的询问,进行临床诊断。本项研究得到了相关伦理学委员会的批准,并对患者进行了书面的知情同意。基因测序：获取16个病人的全血,用商品试剂盒提取DNA。应用primer3在线软件进行引物设计。经过PCR产物纯化后,我们用ABI3130测序仪,对LRP5基因进行了测序(包括第一外显子上游2000个碱基,外显子区域,外显子和内含子交接区域),对检查的SNP位点用PolyPhred进行确认。结果：通过对LRP5进行直接测序,我们发现24个SNP位点,包括3个新的SNP位点。三个新的SNP位点,用PolyPhred软件进行确认。三个新的SNP位点分别命名为LRP5SNP1(c.-1596T>C),LRP5SNP2(c.3764-30G>A)和LRP5SNP3(c.4488+74G>A),分别位于5’端,17内含子和21内含子区域。此外,三个新的SNP位点的最小等位基因频率分别为6.2%,9.4%和12.5%。LRP5SNP3位于内含子21,离21外显子73个碱基,距离rs2201466有20个碱基。没有发现突变位点。结论：AS可能不存在LRP5的基因突变,对于三个新的SNP位点,需要大样本量来验证是否与AS的相关性。第二部分：软骨内骨化相关基因及异位骨化疾病基因与强直性脊柱炎相关性的研究研究背景：强直性脊柱炎是一种高度遗传,常见的风湿疾病,主要是中轴骨骼受累。特征的临床症状是炎性背部疼痛,随着时间的发展,发展为僵直和脊柱的失活动。AS病人相关的病理性骨形成是主要的健康问题,引起患者沉重的社会和经济负担。所以,早期识别有骨化倾向的易感人群有着很重要的意义。目前,AS易感基因的研究主要在炎症和免疫领域,对骨化进行研究的易感基因几乎没有,而骨化又是患者致残的主要原因。TNF-a拮抗剂的应用,对大多数AS病人的临床症状和全身的炎症反应有着长期的控制作用。然而etanercept和infliximab都不能在两年的疗程中减缓AS病人的放射学进展。这就使得研究者急需探讨AS骨化相关的易感基因作为药物干预的靶点。那么,除了炎症和免疫相关的易感基因外,AS病人是否存在骨化相关的易感基因,以及我们如何候选骨化相关易感基因。我们从以下几点来考虑：1)炎症与骨化存在着某种联系,但在更大程度上是两个相互独立的过程,骨化有着自己独立的遗传学基础。2)AS的骨化实质是软骨内骨化,组织病理学研究表明,软骨内骨化和直接的膜内骨形成促成了脊椎关节病的骨僵直。3)AS的软骨内骨化存在着信号通路的失调,存在成骨与破骨的失偶联。已经确定了几个信号通路参与了软骨内骨化过程,如Wnt信号通路、BMP信号通路、hedygehog信号通路以及基质的矿化等。候选基因选取策略：1.通过对以往全基因组扫描结果进行荟萃分析,选择在易感区域内的异位骨化相关基因(BMP6、RUNX2、IHH、COL11A2、ENPP1);2.,参与软骨内骨化相关信号通路内的重要基因(Wnt信号通路：LRP5、DKK1；BMP信号通路：BMP6、BMP2、BMP4；基质矿化通路：DMP1、ENPP1、MG; hedgehog信号通路：IHH；骨化相关转录因子：RUNX2、SOX9);3,异位骨化相关疾病的易感基因(ACVR1、COL11A2);4,治疗异位骨化有效的靶点(PTGS2);5,其他人群全基因组扫描阳性位点基因(ANTXR2)最终,我们选择了15个候选基因进行与AS的相关性研究。实验目的：寻找AS异位骨化相关的易感基因,为AS的治疗提供的新的治疗靶点,抑制AS的病理性骨形成,减少AS病人的致残率。研究方法：研究对象：300个病人,180个与病人组种族相匹配的健康对照人群。所有的病人和健康人群都来自山东汉族人群,年龄范围在11到70岁之间。病人的诊断标准符合84年的纽约诊断标准,病人的骨盆和腰骶部脊柱的影像学由影像学专家来检查。系统的收集病人的临床信息,包括,性别、发病年龄、B27阴性阳性、驼背、竹节样改变以及影像学分级等。在济南市中心血站收集180例种族匹配、无亲缘关系的健康对照人群。基因分型：自肘静脉抽取外周血,抗凝处理后,提取全血基因组DNA。用illmumina goldengate基因分型平台对300个病人,180个对照进行基因分型。SNP选择：用Haploview 4.0,选择涵盖所选基因的整个基因区域(包括第一外显子上游3000个碱基)的TagSNP (r2>0.8),在一个BLOCK区域内,优先选择位于启动子区域、编码区、剪切区域的位点,优先选择错意变异和无意变异位点。位于LRP5基因的rs41494349,rs3736228,LRP5SNP1,LRP5SNP2,LRP5SNP3以及其他与异位骨化相关的SNP位点,被强行加入到TagSNP里面。最终,总共选择了96个SNP位点。统计学分析：去除检测缺失率大于0.1的SNPs位点。只在对照组进行Hardy-Weinberg平衡检验。基因型和等位基因型的比较用fisher chi-square检验。优势比和95%的置信区间用来计算不同等位基因的效应。等位基因相关关系检验用PLINK1.06。基因型、单体型分析用SHEsis在线软件。P值小于0.05有统计学意义。结果：1).入选标准经过正常组中哈温平衡(p>0.05),最小等位基因频率(maf>0.05),单个样本snp检出率(callrate>0.9),单个位点检出率(call freq>0.9)的筛选标准,最终选择296例病例,170例正常对照样本；最终选择SNP位点84个。2).实验的质量控制检验基因分型准确性,进行质量控制,在实验样本中随机选取10个复制样本,结果复制准确率在96%以上。3).关联分析①.病例对照的关联分析A).病例对照单个位点的关联分析有统计学意义的位点有7个,分别位于6个基因上。第一个是rs10019009,位于基因DMP1上；第二个是LRP5SNP3,位于LRP5上；第三个位点是rs16873348,位于基因RUNX2上；第四个位点是rs35565233,也位于RUNX2基因上；第五个位点rs6910759,在BMP6基因上；第六个位点是rs3178250,在BMP2基因上；第七个位点是rs6935458,位于基因ENPP1基因上。B).病例对照的基因型分析有三个位点,位于两个基因上,有DMP1的rs10019009,RUNX2的rsl6873348和RUNX2的rs35565233。C).病例对照的单个基因的单体型分析,有9个基因存在有意义的单体型。分别是DMP1、RUNX2、BMP6、BMP2、ANTXR2、ACVR1、ENPP1、LRP5、PTGS2。②.病例组内部分析A).与竹节样改变相关的等位基因型分析与竹节样改变相关的SNP位点有6个,包括ACVR1的rs7595478,RUNX2的rs7750470,BMP6的rs267180,BMP6的rs267205,BMP2的rs235768,BMP2的rs6054512。B).与竹节样改变相关的基因型分析SNP位点有5个。包括ACVR1的rs7595478,RUNX2的rs7750470,BMP6的rs267180,BMP6的rs267205,BMP2的rs6054512。C).与驼背相关的等位基因型分析SNP位点有RUNX2的rs2820339,RUNX2的rs7750470,RUNX2的rs12665622,BMP2的rs6054512。D).与影像学3、4级相关的等位基因型分析SNP位点有RUNX2的rs2820339,RUNX2的rs7750470,RUNX2的rs12665622,BMP6的rs1225930。E).与疾病早发相关(20岁以前发病)的等位基因型分析SNP位点有IHH的rs7592246,BMP6的rs1358893。F).与男性发病相关的等位基因型分析SNP位点有ANTXR2的rs4333130,BMP6的rs198354,LRP5的rs686921。③.对照组内部的相关性分析A、在对照组中,男女性别差异的等位基因型分析SNP位点有LRP5的rs686921,ANTXR2的rsl2651388,MGP的rs4236。结论：1. DMP1、ENPP1基因可能是通过基质的矿化机制参与了AS的发病2.支持了Wnt信号通路参与AS的发病这一理论。3. BMP6、BMP2、RUNX2可能通过BMP信号通路参与了AS的发病以及异位骨化的形成。4.FOP与AS可能有着相似的异位骨化机制5.环氧合酶2参与了AS的发病6.IHH和BMP6与AS的病情早发相关7. ANTXR2、LRP5和BMP6与男性发病相关第三部分LRP5SNP3位点功能的研究研究目的：LRP5SNP3位于内含子21,在外显子21下游73bp个碱基,在SNP位点rs2201466下游20个碱基,我们假设LRP5SNP3可能是通过影响了内含子和外显子之间的剪切,参与了AS的发病。实验目的,探讨LRP5SNP3是否影响了LRP5的内含子和外显子之间的剪切。研究方法：剪切位点预测软件。应用软件1. NetGene2 (NG2) 2. Automated Splice-Site Analysis (ASSA) 3. MaxEntScan (MES)来预测LRP5SNP3是否影响了LRP5 mRNA的剪切,从而影响LRP5的功能。RT-PCR应用软件primer5设计引物,设计三对引物。第一对引物位于外显子3；第二对上游引物位于外显子20,下游引物位于外显子22；第三对上游引物位于外显子20,下游引物位于外显子22。GAPDH作为内对照。应用商品化试剂盒提取病人及健康人外周血,两步法进行RT-PCR实验。结果：1.通过软件预测,LRP5SNP3没有影响到LRP5 RNA的剪切。2.通过RT-PCR没有检测到LRP5在健康人体内的表达。结论：1.LRP5在外周血中表达比较低,在外周血总RNA提取过程中,RNA可能降解。2.LRP5SNP3可能是通过其他方式参与了AS的发病,比如：影响了LRP5的表达等。3.对LRP5SNP3的研究可能需要非编码DNA、RNA来研究。第四部分DMP1基因rs10019009位点与强直性脊柱炎相关性的实验验证研究研究背景：我们在第二部分的300例病人,180例对照的研究中,发现DMP1基因的rs10019009位点与AS病人有着很强的相关性,p=0.001229,OR=0.64。95%CI[0.49-0.84]。DMP1是一种细胞外基质蛋白,是小整合连接配体N-连接糖蛋白家族成员,对骨及牙本质的正常矿化起着重要的作用,在骨及牙组织中表达。DMP1蛋白中包含很多的酸性结构域,多磷酸化位点,功能性的精氨酸-甘氨酸-半胱氨酸的细胞粘附序列,还含有一个DNA连接序列。在未分化的成骨细胞,它主要作为核蛋白调节着成骨细胞特异性基因的表达。在成骨细胞成熟阶段,蛋白被磷酸化,然后,转移到细胞外基质。在细胞外基质,DMP1参与了矿化基质的形成。DMP1基因突变引起常染色体隐性低磷酸盐血症性佝偻病。研究目的：rs10019009,是个错意变异位点A-T,导致了丝氨酸向半胱氨酸的改变,位于69位氨基酸位置,67-83位氨基酸是DMP1基因的第一保守区,糖胺聚糖区域,该区域对DMP1的矿化成核起着重要的作用。由此,我们认为rs10019009可能是导致AS发病的一个功能位点,所以,对rs10019009位点进行实验验证。研究方法：研究对象：从省立医院、山东省中医院、济宁医学院附属医院和临沂市人民医院,收集AS病例350例,所以病例符合84年纽约诊断标准。从济南市中心血站收集健康人血液400例。DNA的提取：提取外周血基因组DNA。静脉血250μl,采用Omega E-Z 96血液基因组DNA提取试剂盒(E-Z 96 Blood DNA Kit)提取血液DNA,具体操作见DNA提取试剂盒。用Merinton SMA1000分光光度计测定DNA浓度,终浓度达到100ng/ul,所测A260/A280值为1.65-1.80。将DNA稀释到20-50ng/μl,-40°保存备用。基因分型：采用TaqMan-PCR的方法基因分型,位点探针由生物系统公司(Applied B iosystems)合成。反应体系10μl,包括探针Mix, Lightcycler480 Probe Master、PCR Grade H2O和DNA样品,反应在Lightcycler480 PCR仪上进行。Endpoint Genotyping法分析结果。用在线软件SHEsis和SPSS11.5软件包进行统计分析,统计过程排除基因分型失败个体。结果：病例对照的相关性分析：1.rs10019009 SNP位点与AS的相关性没有统计学意义,p=0.242,但风险型等位基因T与AS病人连锁不平衡。2.实验第一部分的人群和实验第二部分的人群合在一起,进行病例对照分析,rs10019009与AS有着很强的相关性,经过多重检验校正后,p值仍然小于0.05。结论：Rs10019009是DMP1重要的SNP位点,可能参与了AS的发病。第五部分DMP1基因的rs10019009位点对U20S细胞矿化机制的研究研究目的：探讨SNP位点rs10019009位点,参与U20S细胞矿化的机制,从而为控制AS的骨化,提供作用靶点。研究方法：1.用蛋白质分析软件,分析DMP1的三级结构,功能保守区,与活性位点区域。用SNP功能预测软件,预测rs10019009,对DMP1功能的影响。2.U20S细胞的培养。U20S细胞是低磷酸酶活性,没有矿化能力的人类成骨样细胞。RT-PCR检测没有转染外源基因的U20S细胞的DMP1表达水平。3.质粒构建。构建pEGFP-N1-DMP1表达质粒。定点诱变rs10019009位点,碱基a(丝氨酸)-碱基t(半胱氨酸)-碱基c(精氨酸)碱基g(甘氨酸)。并将定点诱变后的质粒转染到U20S细胞。4.实验分组。分为加矿化诱导剂组和未加矿化诱导剂组,转染DMP1组和未转染组,并在不同的组中,细胞培养0天,48小时,5天进行细胞表型检测。5.细胞表型检测。茜素红染色检测U20S细胞的矿化结节；碱性磷酸酶检测ALP活性；RT-PCR检测ALP、DMP1、骨钙素、RUNX2、BMP2、BMP6的表达水平。结果：1.rs10019009位于DMP1的保守区,对DMP1的功能产生一定的影响。2.成功定点诱变了rs10019009 SNP位点,并成功转染到U20S细胞,转染效率75%。3.未检测到没有转染外源基因的U20S细胞表达DMPl。4.ALP活性检测,发现T等位基因(风险型等位基因的)活性比A等位基因(保护型等位基因)的活性高,p<0.05.结论：1.rs10019009是DMP1基因重要的SNP位点,可能影响DMP1的基因功能。2.U20S细胞是很好的研究DMP1基因功能的细胞模型。为DMP1基因功能的研究奠定了基础。3.进一步在功能上证明了T等位基因是风险型等位基因。