目的：　　 肠三叶因子3(Trefoil Factor3，TFF3)是三叶草因子家族的成员之一，为一种调节性小肽。我们前期实验数据表明：TFF3可以诱导NF-κB激活，伴随IκB磷酸化。TFF3诱导IκB不完全降解，IκB的丝氨酸介导磷酸化参与这个过程；TFF3诱导NF-κB同源二聚体p65/p65瞬时激活，同时调节Twist蛋白表达。　　 Twist基因是最早在果蝇中发现的一种碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子，能与转录因子NF-κB相互作用，近期发现Twist作为NF-κB信号通路的负调控因子，抑制NF-κB依赖的转录激活，调节转录。　　 NF-κB信号通路的激活，需要其上游调控分子的精准控制，以保证其激活的特异性调节，实现刺激或组织特异性应答。IκB激酶复合物(IκBKinases)作为NF-κB信号通路的上游关键调控分子，对NF-κB的激活起到重要作用，研究发现：IL-1可以激活IκB激酶2触发NF-κB信号通路的激活，启动靶基因转录，引起炎症反应。CHUKl(Conserved H-L-H Ubiquitiuos Kinasel)是我们前期筛选的IκB上游调控子同型亚基的一个分子片段，研究提示其同型亚基参与NF-κB信号通路调控，新近研究表明其调控对于NF-κB信号通路激活相关的固有免疫和获得性免疫应答调节起到重要作用。有研究提示它的同型分子受到多个交叉通路的调节，目前发现丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路中的分子MEKK1、MEKK2、MEKK3和NIK等参与此调节。　　 丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路是介导细胞外刺激向内转导反应的主要信号系统，普遍存在于多种生物中。激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路可通过磷酸化等方式调节转录因子，细胞骨架相关蛋白，酶类等多种底物，参与介导生长、发育、分化、凋亡等生理过程。　　 丝裂原活化蛋白上游激酶作为丝裂原活化蛋白激酶信号通路的一个基本成员，起到传递细胞外信号进而激活细胞内下游通路的关键近受体调控作用。p64是上游激酶家族新辨认的成员，其所编码的蛋白为Ser/Thr蛋白激酶家族一员，参与发育相关信号通路，可能在多条炎症，肿瘤信号通路中起到不可缺的重要作用，并能够参与NF-κB信号通路调节。　　 我们小组前期的研究表明：TFF3诱导的NF-κB瞬时激活伴随Twist蛋白的上调表达，ERK激酶的特异抑制子可以下调TFF3诱导的Twist表达。有研究提示，ERK激酶的激活受到丝裂原活化蛋白上游激酶家族分子的调控，而且该激酶家族分子参与NF-κB激活调控，但是TFF3如何参与此类上游激酶家族成员调节及该调节应答对NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶信号通路的效应及调节机制并不清楚，本研究意在探讨p64及CHUK1在TFF3-Twist-NFκB信号通路中的作用及其可能由Twist介导的TFF3应答调节机制和TFF3诱导NF-κB激活效应。　　 方法：　　 1、构建实验相关质粒。　　 2、RT-PCR和Western Blot技术检测TFF3过表达。　　 3、RT-PCR和Western Blot方法检测TFF3调节的Twist，p64和CHUK1表达变化。　　 4、体外GST-pull down实验验证p64与CHUK1的相互作用关系。　　 5、免疫共沉淀验证p64与CHUK1相互作用的体内效应。　　 6、双荧光素酶报告系统分析TFF3对NF-κB启动子活性的调节。　　 7、Western Blot技术结合Twist干扰检测CHUK1的调节表达。　　 结果：　　 1、成功构建了原核表达载体pGEX-5X-1-p64和真核表达载体pcDNA3.1/HisC-CHUK1。　　 2、TFF3过表达上调Twistl，p64和CHUK1转录和蛋白表达水平。　　 3、体外GST-pull down实验证实p64与CHUK1能够直接作用。　　 4、免疫共沉淀实验进一步证实p64与CHUK1在体内相互作用，且在TFF3高表达状态下相互作用增强。　　 5、双荧光素酶报告系统证实TFF3增强NF-κB启动子活性。　　 6、RNA干扰实验证实，阻断Twist表达后，提示CHUK1蛋白表达水平上调。　　 结论：　　 实验显示p64和CHUK1表达受TFF3高表达调控，并可能通过p64和CHUK1直接互作参与TFF3-Twist-NFκB信号途径调节，TFF3调节p64和CHUK1发生互作增强；同时，TFF3增强NF-κB启动子活性；TFF3上调的Twist表达可能调节NF-κB活性，Twist的调节作用需要NF-κB上游特异调节子介导来实现。