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RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)介导的一种特异性基因表达沉默,是一种古老但在进化上又高度保守的基因表达调节机制。关于RNAi的基础研究和应用研究迅速成为21世纪初生命科学的热点之一,在人、小鼠及其他哺乳动物中,RNAi已广泛应用于基因功能验证、信号转导和基因治疗等领域的研究。由于哺乳动物缺乏体内siRNA介导的沉默放大效应,利用DNA载体在细胞内稳定转录出siRNAs,并维持长时间抑制效果的方法已被证明是行之有效的。转化生长因子β(TGF-β,transforming growth factors beta),在细胞生长、发育、分化和物质代谢等方面均有极其重要的作用,而Smads蛋白是目前所知的唯一的TGF-β受体胞内激酶底物,在TGF-β信号转导中起着关键的作用。本研究通过构建RNAi的DNA表达载体,特异地、有效地抑制TGF-β/Smads信号通路中通路特异性Smads-Smad2和Smad3基因在NIH/3T3小鼠成纤维细胞中的表达,分别在mRNA水平和蛋白质水平研究Smad2和Smad3的不同作用和相互关系及在TGF-β信号转导过程中所处的地位。具体研究结果如下:
1.确定了外源TGF-β1诱导NIH/3T3细胞中Smads蛋白表达的最佳浓度和时间。通过设置添加TGF-β1处理的不同浓度梯度和时间梯度,利用半定量RT-PCR.和Western-blottting分析方法确定诱导Smads蛋白达到最高表达量的浓度和时间分别为5μg/L和3小时,并发现Smad3的表达对TGF-β1的刺激尤为敏感,从0.5小时起一直持续高效表达。
2.构建了靶基因的shRNADNA表达载体。按照siRNA的设计规则,针对Smad2和Smad3基因分别设计了5条21bp的siRNA序列,合成了10条62-64bp的双链DNA寡核苷酸序列,并将它们分别插入到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen质粒载体中,获得了包括阳性和阴性对照的12个shRNA的DNA表达质粒,并经酶切和测序验证。
3.建立了一套比较有效的RNAi的技术体系。将所获得12个RNAi表达质粒利用脂质体介导的方法分别转染NIH/3T3小鼠成纤维细胞,提取转染细胞的总RNA和总蛋白质,采用半定量RT-PCR和Western-blotting方法分析了siRNA抑制效果,获得了两个特异地、有效地抑制Smad2和Smad3表达的RNAi表达质粒。分析这两个有效的siRNA序列发现,正义链第10位的碱基在设计中具有重要的作用,当第10位为U时,抑制效率最高,其次是C,最后是A/G。
4.分析了Smad2和Smad3在TGF-β信号转导过程中的不同作用。在mRNA水平和蛋白质水平分别检测了Smad2-depleption细胞、Smad3-depleption细胞和Smad2+3-depleption细胞中Smad2、Smad3和Smad4的表达,发现在Smad2-depleption细胞中Smad3和Smad4的表达提高,而在Smad3-depleption细胞中Smad2的表达没有发生改变,Smad4的表达降低。表明TGF-β信号在NIH/3T3细胞转导过程中,Smad3起到关键的调节作用。
5.建立了混合RNAi表达质粒有效地抑制靶基因表达的方法。分别针对于Smad2和Smad3 mRNA序列不同区段的4个shRNA表达质粒等比例混合,构成Smad2-RNAi池和Smad3-RNAi池,利用脂质体将RNAi混合质粒共同导入NIH/3T3细胞中,经半定量RT-PCR和Western-blotting方法分析,发现RNAi池抑制Smad2或Smad3表达的效果要明显高于单一的RNAi表达质粒。表明针对靶基因mRNA序列不同区段的混合RNAi表达质粒可以提高RNAi的抑制效果,为有效利用RNAi表达载体研究基因的功能提供了一个新的策略。