诱导小鼠多能干细胞分化为角膜上皮细胞的实验研究

来源 :大连医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hunan341
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目的:探讨鼠源诱导多能干细胞(mice induced pluripotent stem cells,miPSCs)通过与小鼠角膜基质细胞共培养途径诱导分化为角膜上皮的可行性,检测miPSCs向角膜上皮细胞分化后形态学变化以及部分标志蛋白表达的变化,为研究miPSCs向角膜上皮的分化提供实验依据。方法:购买小鼠ips细胞株和辐射后小鼠胚胎成纤维细胞株(mouse embryonicfibroblast MEF),使用饲养层细胞法培养扩增小鼠来源ips细胞。应用Western blotting法检测诱导分化前鼠源ips细胞多能性标志性蛋白Oct4、Nanog和Sox2的表达以进行鉴定。体外分离,增殖小鼠角膜基质细胞。将鼠源iPSCs在体外环境与小鼠角膜基质细胞共培养以诱导分化。应用倒置显微镜观察诱导分化1周后miPSCs的形态学变化,并应用免疫荧光法检测miPSCs分化后角膜上皮标志蛋白K12的表达变化,RT-PCR法检测细胞分化后K12的mRNA表达。结果:培养的miPSCs复苏3天后在倒置显微镜下观察呈克隆样生长,克隆呈圆形或椭圆形,边界清楚。克隆内细胞排列紧密,细胞体积小,核大,核仁清晰,细胞核/质比高。应用Western blotting对其miPSCs进行鉴定,结果显示细胞均表达多能性标志性蛋白Oct4、Nanog和Sox2;分化后细胞呈多角形,胞体发暗,排列疏松,细胞核/质比变小。免疫荧光法检测分化前miPSCs的K12均未见表达,miPSCs经1周的诱导分化后其细胞均表达角膜上皮标志蛋白K12。结论:使用饲养层细胞法扩增小鼠来源ips细胞能够使其在扩增数代后仍然保留有多向分化潜能而不分化。在体外与小鼠角膜基质细胞共培养,能够将鼠源iPSCs细胞定向诱导分化成为角膜上皮样细胞,使miPSCs不仅从形态学上向角膜上皮分化,同时成功表达角膜上皮细胞标志蛋白K12。
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