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研究背景与研究目的:皮肤是由表皮、真皮及皮下组织构成的人体最大器官,具有调节人体温度、维持内环境稳定、阻止化学物质及微生物进入等作用。皮肤损伤包括烧烫伤、外伤、糖尿病足导致的损伤等,严重的皮肤损伤可以是致命的。皮肤烧烫伤是指因热力、热液、化学物质、放射线、光、以及电等作用于人体而引起的损伤,主要包括皮肤或粘膜损伤,严重者可能伤及皮下组织,是日常工作和生活中最常见且极其复杂的外伤疾病之一。目前,深度皮肤烫伤的治疗效率不高,伤口愈合缓慢,导致新生皮肤组织无泌汗功能、缺乏弹性,且常常伴随瘢痕形成。因此,寻找治疗皮肤烫伤、加快皮肤创面愈合的新方法迫在眉睫。间充质干细胞是一簇来源于组织中胚层间质的能够进行自我更新和多向分化的干细胞,它属于成体干细胞的一种。近年来,大量的研究表明间充质干细胞可以产生和分泌多种细胞因子,促进皮肤的损伤修复。人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)是一种来源于新生儿羊膜的新型干细胞,具有取材方便、增殖能力强、无伦理障碍、安全不致瘤性等优点。hAMSCs是否可以促进皮肤烫伤的损伤修复?其具体的作用机制及分子机制又是什么?到目前为止,还没有相关报道。本文旨在探讨hAMSCs对深Ⅱ度皮肤烫伤的治疗作用及其机制,从而为寻找治疗皮肤烧烫伤的新方法及新靶点提供实验依据。实验方法:1.hAMSCs的分离、培养及鉴定:1)利用胰酶及胶原酶从羊膜上分离及培养hAMSCs;2)利用流式细胞术、RT-PCR及免疫荧光检测hAMSCs表面分子标志;3)成骨成脂分化检测hAMSCs体外多向分化潜能:4)利用软琼脂集落形成实验及NOD-SCID小鼠体内移植实验检测hAMSCs体内及体外致瘤性。2.hAMSCs、hAMSC-CM促进深Ⅱ度皮肤烫伤损伤修复的潜能及作用机制研究:1)利用自制皮肤烫伤装置构建小鼠深Ⅱ度皮肤烫伤模型;2)将PBS、PKH26标志的hAMSCs、H-DMEM及hAMSC-CM原位注射在皮肤烫伤伤口附近,计算不同组别小鼠在在不同时间点伤口的面积;3)利用活体成像及免疫荧光检测hAMSCs在深Ⅱ度皮肤烫伤小鼠体内的存活、迁移及分化;4)利用HE染色、TUNEL凋亡染色、PCNA及CK19免疫组化及Western blot检测不同组别小鼠皮肤组织中热损伤皮肤细胞凋亡及增殖情况。3.hAMSCs、hAMSC-CM促进皮肤损伤修复的分子机制研究:1)体外建立表皮细胞HaCAT及真皮成纤维细胞DFL的热损伤模型,并利用Transwell共培养小室构建hAMSCs与HaCAT及DFL细胞的共培养体系;2)利用Annexin V/PI流式细胞凋亡实验、CCK8实验、划痕实验检测正常培养组、热损伤组、热损伤后hAMSCs共培养组及hAMSC-CM处理组热损伤皮肤细胞的凋亡、增殖及迁移;3)Western blot检测正常培养组、热损伤组、hAMSCs共培养组及hAMSC-CM处理组热损伤皮肤细胞中PI3K/AKT及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达;4)在hAMSCs与HaCAT及DFL细胞的共培养体系加入AKT抑制剂LY294002及β-catenin的抑制剂ICG001,利用流式细胞凋亡检测及Western blot检测其在hAMSCs抑制热损伤皮肤细胞凋亡、促进其增殖过程中发挥的作用;5)抗体芯片检测hAMSC-CM中440种细胞因子的表达水平,并筛选出可能激活PI3K/AKT信号的候选因子。实验结果:1.hAMSCs具有间充质干细胞的特性:1)利用两步消化法可从羊膜上分离培养得到具有典型间充质干细胞形态的hAMSCs,且hAMSCs扩增能力极强;2)RT-PCR、流式细胞术及免疫荧光检测表明hAMSCs表达间充质干细胞标志基因CD105、CD29、CD73、CD90及胚胎干细胞标志基因Oct-4、Nanog、SSEA-4,不表达造血干细胞标志基因CD34、CD133及CD45,不表达主要组织相容性Ⅱ类抗原HLA-DR,低表达主要组织相容性Ⅰ类抗原HLA-ABC,但不表达其共同刺激分子CD80、CD86及CD40,表明hAMSCs具有极低的免疫原性;2)hAMSCs可在体外定向分化为骨细胞及脂肪细胞:3)成瘤/致瘤研究表明,hAMSCs在体内及体外均不致瘤。2.hAMSCs及hAMSC-CM体内移植可通过抑制热损伤皮肤细胞的凋亡、促进热损伤皮肤细胞的增殖促进深Ⅱ度皮肤烫伤损伤修复:1)80℃热水烫伤100s可成功构建小鼠深Ⅱ度皮肤烫伤模型:2)通过计算伤口面积及伤口愈合率表明hAMSCs及hAMSC-CM体内移植可促进深Ⅱ度皮肤烫伤的创面愈合:3)活体成像及免疫荧光检测表明hAMSCs可在小鼠皮肤烫伤部位存活超过21天且未分化为其它类型细胞,但细胞数目逐渐减少;4)TUNEL凋亡检测表明hAMSCs及hAMSC-CM可抑制热损伤皮肤细胞的凋亡,免疫组化及Western blot检测表明hAMSCs及hAMSC-CM可促进热损伤皮肤细胞的增殖。3.hAMSCs及hAMSC-CM可通过旁分泌作用激活PI3K/AKT及Wnt/β-catenin信号通路抑制热损伤皮肤细胞凋亡、促进热损伤皮肤细胞增殖:1)43℃处理50min,可成功在体外构建HaCAT及DFL细胞热损伤模型;2)hAMSCs及hAMSC-CM体外共培养可抑制热损伤皮肤细胞凋亡并促进其增殖及迁移;3)hAMSCs通过激活PI3K/AKT信号通路,抑制热损伤皮肤细胞的凋亡,而PI3K/AKT信号通路的活化,又可进一步激活Wnt/β-catenin信号通路,而促进热损伤皮肤细胞的增殖;4)抗体芯片检测表明,hAMSCs可能通过分泌包括PAI-1、G-CSF、Periostin及TIMP-1等在内的一系列细胞因子激活PI3K/AKT信号通路来促进皮肤烫伤的损伤修复。结论:1.hAMSCs具有增殖能力强、表达间充质干细胞及胚胎干细胞标志基因、不表达造血干细胞标志基因、免疫原性低、具有多向分化潜能、不致瘤等特征;2.hAMSCs及hAMSC-CM体内原位移植可通过旁分泌作用促进深Ⅱ度皮肤烫伤的损伤修复,其机制与hAMSCs及hAMSC-CM抑制热损伤皮肤细胞的凋亡及促进热损伤皮肤细胞的增殖有关;3.hAMSCs可分泌PAI-1、G-CSF、Periostin及TIMP-1等因子,通过旁分泌作用激活PI3K/AKT信号通路抑制热损伤皮肤细胞的凋亡,而PI3K/AKT信号通路的活化又进一步激活Wnt/β-catenin信号通路,继而促进热损伤皮肤细胞的增殖。