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采用平板透明圈法初筛和摇瓶培养复筛的方法从25株虫生真菌筛选出产海藻糖酶最高的菌株。
采用单因素筛选法来研究碳源、氮源以及维生素等对产酶量的影响,结果表明可溶性淀粉、蛋白胨、VB2、pH6和金属离子K+为最适合海藻多糖酶发酵培养单因素。座壳孢最佳产酶培养基为2.5 g/L的可溶性淀粉、5g/L蛋白胨、4×10-4mol/LK+、o.05g/LVB2和pH5.5;最佳产酶条件为为接种量15ml、装液量50 mL、菌龄7d和培养时间3d。在液体摇瓶发酵条件下利用优化的培养条件,座壳孢WYTM-2海藻糖酶产酶活力达到29.38U/mL。
以最优培养基在最优条件下培养座壳孢WYTM-2获得的发酵液为材料,经硫酸铵沉淀、离子交换和凝胶层析,获得纯化的海藻糖酶;经SDS-PAGE电泳验证表明该纯酶蛋白的分子量约为40KDa。
对纯化的海藻糖酶进行酶学特性研究,结果表明,该酶的最适作用温度为30℃,在40℃条件下稳定性最好;该酶在pH-16-pH7范围内有较高的酶活性,在pH6.5条件下稳定性最好;Na+、Mn2+、Fe3+对该酶起激活作用,Mg2+和A13+抑制了该酶的活性;甲醇、戊醇、丙酮和二氧六环对该酶起激活作用,乙二醇、甲醛和戊二醛抑制该酶,正丁醇和丙三醇对该酶先扬后抑。Mg2+对海藻糖酶的抑制表现为可逆效应,抑制机理是竞争性的,Mg2+对酶的pH稳定性的影响不明显,温度高于60℃后,随着Mg2+浓度的增加,酶的热稳定性相对增加。