随着人类对海洋生物资源的不断发掘,海藻酸寡糖的多种生理活性受到广泛的关注。海藻酸裂解酶,尤其是内切型海藻酸裂解酶,作为高效、环保的海藻酸降解和不同寡糖的制备工具得到了较多研究。近年来,海藻酸作为新一代生物乙醇的生产原料,有关海藻酸分解菌的筛选、微生物的海藻酸代谢途径以及海藻酸乙醇发酵工程菌的构建等研究开始逐渐变多。但是,对海藻酸彻底降解为单糖,进而在海藻酸分解菌细胞内代谢途径的研究还不够深入,限制着对海藻酸乙醇转化工程菌的构建和应用。本文利用实验室分离的海藻酸分解菌Sunxiuqiniasp.SH-52、已在大肠杆菌中异源表达的三种海藻酸裂解酶,采用海藻酸裂解酶的协同作用、基因组学、转录组学、不同碳源对Sunxiuqinia sp.SH-52中海藻酸裂解酶诱导表达的影响和Sunxiiuqinia sp.SH-52中海藻酸裂解酶SHA-I的原核表达等方法,对海藻酸降解机理、厌氧海藻酸分解菌的海藻酸代谢途径和海藻酸裂解酶SHA-I的特性进行了研究。获得如下结果:1.重组海藻酸裂解酶ZHO-Ⅱ、ZHO-Ⅲ和ZHO-Ⅳ海藻酸降解协同作用的研究本研究利用重组海藻酸裂解酶,内切型海藻酸裂解酶ZHO-Ⅱ、ZHO-Ⅲ和外切型海藻酸裂解酶ZHO-Ⅳ对海藻酸的协同降解进行研究。当以海藻酸为底物时,ZHO-Ⅱ和ZHO-Ⅲ有协同作用。当以聚甘露糖醛酸(PM)为底物时,ZHO-Ⅳ与ZHO-Ⅲ的协同作用比与ZHO-Ⅱ要强。当以聚古洛糖醛酸(PG)为底物时,ZHO-Ⅳ与ZHO-Ⅱ的协同作用比与ZHO-Ⅲ要强。结果表明,以PM和PG为底物时,三种酶协同作用较强,所以在制备单体时,可以先将海藻酸进行预处理,降解为PM和PG时,然后用海藻酸裂解酶进行水解效率会更高。2.Sunxiuqinia sp.SH-52全基因组测序及海藻酸代谢相关基因的分析测序结果表明,基因组长度为4593397bp,平均GC含量为46.56%,得到3904个ORFs,并且发现了 52个tRNA和3个rRNA。对全基因组测序中的五个海藻酸裂解酶进行系统进化分析。通过对Sunxiuqiniasp.SH-52海藻酸裂解酶与相应家族海藻酸裂解酶氨基酸序列比对分析表明,SHA-Ⅰ和SHA-Ⅱ为PL7家族,SHA-Ⅲ、SHA-Ⅳ和SHA-Ⅴ属于PL6家族,并对其催化位点进行分析。3.厌氧海藻酸分解菌Sunxiuqiniasp.SH-52海藻酸代谢途径的研究本研究通过抑制剂的添加对SH-52代谢的影响和转录组学方法对Sunxiuqini a sp.SH-52海藻酸的代谢途径进行研究。分别以葡萄糖和海藻酸为底物培养SH-52,添加碘乙酸和氟化钠对SH-52生长都有抑制作用,但以葡萄糖为底物时的抑制作用更强,说明SH-52代谢利用海藻酸需要3-磷酸甘油醛脱氢酶和丙酮酸激酶,通过部分的糖酵解途径。转录组结果表明,多个周质运输蛋白、ABC-转运子和MSF转运子基因明显上调表达,说明海藻酸是在这些转运蛋白蛋白的作用下从胞外运输到胞内。五个海藻酸裂解酶基因、KdgK基因、KDPG aldolase基因明显上调表达式。通过序列比对初步确定了 short-chain dehydrogenase/reductase SDR 即为 DEH 还原酶,说明海藻酸在运输到胞内后,在海藻酸裂解酶的作用下降解为DEH单体,DEH还原酶将单体转变为KDG,然后在KDGK的作用下转变成KDPG,KDPG aldolase催化KDPG进入ED途径,丙酮酸代谢主要流向产乙酸途径。4.不同碳源对Sunxiuqinia sp.SH-52海藻酸裂解酶的诱导表达以及特性分析SH-52的诱导源很窄,只有海藻酸、PM、PG能强烈的诱导海藻酸裂解酶的表达,半乳糖可以微弱的诱导。海藻酸、半乳糖、葡萄糖两两作用对海藻酸裂解酶诱导时,葡萄糖阻遏了海藻酸对海藻酸裂解酶的诱导,而对半乳糖诱导时影响不大;半乳糖与海藻酸共同作用时则减缓了海藻酸裂解酶的表达,在转录水平也进行分析。本研究对海藻酸裂解酶基因SHA-I进行原核表达,并进行特性分析。研究表明纯化前的总蛋白为162mg,纯化后剩余3.2mg。纯化后蛋白酶活达到13U/mg,而未纯化的粗蛋白酶活仅为2.6U/mg,纯化倍数为5倍。SHA-I是polyM特异性海藻酸裂解酶,最适温度为50℃,最适pH为7.0,可以在35℃以下保持稳定。