哺乳动物卵泡发育是一个复杂的过程，主要包括卵母细胞的生长和减数分裂、颗粒细胞增殖、分化，涉及卵母细胞和颗粒细胞间的协同发育和调控等。蛋白激酶C(PKC)超家族包括多种成员，主要分为三类，经典型PKC、新型PKC和非典型PKC。PKC超家族成员在多种细胞类型的增殖和分化等过程中发挥着重要的调控作用。PKC信号通路在哺乳动物卵母细胞减数分裂恢复过程中发挥着重要的调节作用，卵丘细胞中PKC的活化可以促进卵母细胞恢复减数分裂，而卵母细胞中的PKC则抑制卵母细胞成熟，但是PKC在卵泡发育过程中的作用尚不明了。本课题利用小鼠腔前卵泡体外培养模型和PKC广谱抑制剂staurosporine(星形孢菌素)，研究在腔前卵泡体外培养过程中的不同阶段抑制PKC后其对卵泡发育、颗粒细胞增殖和细胞凋亡的影响，并通过检测抑制PKC后对卵泡颗粒细胞缝隙连接蛋白connexin(Cx)43的定位和表达、Smad家族成员Smad4的表达等，尝试揭示PKC参与卵泡发育和颗粒细胞功能的调控机制。主要研究结果如下:　　 1.抑制PKC严重影响小鼠腔前卵泡的体外发育进程。从出生后12天雌性昆明小鼠卵巢内剥离出腔前卵泡进行体外培养，同时向培养液中添加1μM PKC抑制剂staurosporine，48h后在显微镜下观察腔前卵泡体外发育过程中的形态变化。添加了staurosporine培养的腔前卵泡形态与对照组相比颗粒细胞变圆、卵泡边缘变得模糊，卵母细胞在staurosporine处理48小时发生萎缩死亡。同时为了研究PKC在成熟卵泡体外排卵过程中的作用，在体外将腔前卵泡培养至有腔成熟阶段后，给卵泡加入含激素的排卵诱导成熟液，16h后观察卵母细胞排出情况以及卵母细胞成熟情况（是否GVBD、是否排出第一极体）。添加了staurosporine的实验组中，成熟卵泡的排卵活动完全受到了抑制，即使有排出卵母细胞，也是已经死亡的卵母细胞。　　 2.抑制PKC对颗粒细胞增殖具有显著影响。取小鼠颗粒细胞进行体外培养，约72小时后细胞生长到所需密度，给细胞更换含不同浓度(0.2μM、0.5μM、1μM)staurosporine的培养液继续培养14小时后，显微镜下观察形态变化且拍照，并处理细胞进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。颗粒细胞形态随着抑制剂浓度的增加发生变化，细胞膜呈丝状向四周扩展，同时早期凋亡率也显著上升，对照组为5.31％，0.2μM组上升到16.67％，0.5μM组则为26.55％，1μM组则升高到32.15％，SPSS统计分析表明随着staurosporine浓度的增加凋亡率上升，并表现出显著差异。　　 3.抑制PKC后影响腔前卵泡体外发育过程中缝隙连接蛋白connexin43的定位模式。向体外培养的腔前卵泡添加1μM staurosporine培养48h后，利用免疫荧光细胞化学检测缝隙连接蛋白connexin43在颗粒细胞中的定位。结果显示，对照组的腔前卵泡中，Cx43定位在卵泡内围绕在卵母细胞周围的颗粒细胞之间，当卵泡受到staurosporine的抑制后，Cx43的定位尽管还在颗粒细胞之间，但显得杂乱无序，且信号微弱。单独培养的颗粒细胞中抑制PKC后，与对照组培养的颗粒细胞中Cx43的定位模式进行比较，结果发现Cx43尽管仍然定位在细胞膜上，但不能形成完整的细胞缝隙连接通道。同时磷酸化的Cx43在颗粒细胞中的表达也有所降低。这些结果暗示抑制PKC后破坏了细胞缝隙连接通道，阻断了颗粒细胞之间的通讯及物质运输与交换，结果导致颗粒细胞功能和卵泡发育受到显著抑制。　　 4.抑制PKC后影响腔前卵泡体外发育中Smad家族成员Smad4蛋白的表达水平。在哺乳动物卵泡早期发育中，卵母细胞合成和分泌的TGFβ家族成员GDF9和BMP15与周围颗粒细胞表达的Smad复合物结合，对颗粒细胞的增殖和分化具有重要调节作用。利用Western blot发现在PKC受到抑制的腔前卵泡中Smad4蛋白表达量上升，这些结果暗示PKC抑制后可能阻断了卵母细胞和颗粒细胞之间的交流和通讯，促使颗粒细胞增殖或分化阻滞，最终颗粒细胞为了自身的增殖和分化，故而合成更多的Smad4以尝试接受来自卵母细胞的GDF9和BMP15信号。而随着培养时间的延长，颗粒细胞发生大量凋亡或异常，进而导致Smad4合成的减少或降解的增加，导致其表达水平显著下降。　　 总之，研究结果说明PKC通路对小鼠腔前卵泡体外发育具有重要调节作用，其作用可能是通过调控缝隙连接蛋白Cx43的表达和定位模式，参与了卵泡中卵母细胞和颗粒细胞之间的通讯和交流、以及颗粒细胞之间的交流，最终对颗粒细胞的增殖和凋亡，以及卵母细胞生长产生调控作用。