肝癌是威胁人类健康的重大疾病,位居全球恶性肿瘤发病率的第六位,每年新发病例626000多例,其中约半数发生在我国,死亡率位居中国各种肿瘤死亡率的第2位。肝癌恶性程度高,许多患者初诊时即为晚期而失去手术机会,放、化疗及分子靶向治疗是中晚期肝癌的主要治疗手段,但因受限于放化疗治疗的药物毒副作用及复发耐药等多种原因,肝癌患者的5年生存率并无明显提高。中草药在我国有着广泛、悠久的使用历史,许多学者试图从中草药寻找高效、低毒有效成分,能抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡而不损伤正常细胞,从而为肝癌的临床治疗提供一种新途径。参麦注射液源于古方“生脉散”,是由红参、麦冬加工提炼精制而成的纯中药复方注射剂,该药具有益气固脱,养阴生津,生脉等功效,在临床广泛应用于治疗气阴两虚型之休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺心病、肿瘤等疾病。近年参麦注射液广泛应用于肺癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌等恶性肿瘤的治疗,能显著提高肿瘤病人的免疫机能,抑制肿瘤血管生成,单独或与化疗药物联用时均可以发挥抗肿瘤作用,与化疗药物合用时有一定的增效作用,同时能减少化疗药物所引起的毒副反应。参麦注射液还可以改善肝癌介入治疗后患者临床症状,减轻不良反应,提高生活质量,也有报道,参麦注射液在体外能明显抑制部分肝癌细胞的增殖。尽管参麦注射液已在临床广泛应用,其潜在的抑制肿瘤的分子机制仍未完全明确。p53基因的功能与肿瘤发生的关系密切。在人类肿瘤中,p53基因突变是最常见的基因突变,大约有50%的肿瘤患者会出现p53基因突变,突变的p53基因表达突变的P53蛋白,不能进行DNA修复和控制细胞分裂。在肝癌细胞中,p53基因往往出现突变或异位缺失,突变后的p53基因失去肿瘤抑制基因的功能,甚至激活癌基因,使肝癌细胞耐药。鉴于以上研究现状,本研究拟通过建立人正常肝细胞系L-02,人肝癌p53非缺失HepG2细胞系和p53缺失的人肝癌Hep3B细胞系的药物处理模型,在此基础上,运用细胞分子生物学技术,如流式细胞术、免疫荧光术和western blotting等技术,研究参麦注射液对不同靶细胞增殖和凋亡的影响,并重点探索P53非依赖性细胞信号通路在参麦注射液致细胞损伤应答反应中的作用,初步探讨参麦注射液抑制肿瘤生长的可能机制,为肝癌的临床治疗提供基础理论依据。第一部分 参麦注射液体外抗肿瘤的实验研究目的:以人正常肝细胞L-02、人肝癌细胞HepG2和p53缺失性Hep3B细胞为研究对象,评估参麦注射液对体外培养人正常肝细胞及肝癌细胞增殖、凋亡的影响,初步探讨参麦注射液抑制肿瘤生长的可能机制。方法:MTT检测4、8、16、32mg/mL参麦注射液作用L-02细胞、HepG2细胞和Hep3B细胞12h、24h的存活率;Annexin V-PI双染法及流式细胞仪检测不同浓度的参麦注射液12h、24h对人肝细胞及肝癌细胞凋亡的影响。结果:1、细胞存活率用设定的参麦注射液浓度处理L-02、HepG2及Hep3B细胞,MTT实验发现,参麦注射处理L-02细胞,与对照组相比,在12h和24h对L-02细胞均无抑制作用,16mg/mL药物处理L-02细胞24小时,可以促进L-02细胞存活率的增加(108%)。HepG2、Hep3B细胞株,随着参麦注射液处理浓度的增加,细胞存活率显著性下降,呈剂量依赖关系;在32mg/mL参麦注射液处理24h,HepG2细胞及Hep3B细胞的细胞存活率分别降至对照组的70%及50%左右。2、细胞凋亡率用设定浓度的参麦注射液处理HepG2、Hep3B细胞,发现在12h和24h,随着参麦注射液浓度的增加,凋亡细胞数量显著性增加,且呈剂量-效应关系;在参麦注射液处理12h,细胞凋亡以早期凋亡为主,而到了 24h,晚期凋亡细胞数随处理浓度增加逐渐增加,呈剂量依赖关系。小结:参麦注射液在体外对L-02细胞无增殖抑制效应,能够抑制HepG2、Hep3B细胞的增殖,促进两类肝癌细胞凋亡,此效应呈剂量和时间依赖性。第二部分 参麦注射液对肝癌细胞氧化应激损伤的实验研究目的:以细胞株HepG2(p53非缺失)和Hep3B(p53缺失)为研究对象,初步探讨参麦注射液诱导细胞凋亡的发生机制,为进一步探索参麦注射液促进肿瘤细胞凋亡的的分子信号通路提供线索。方法:4、8、16、32mg/mL参麦注射液作用于HepG2和Hep3B细胞24h,以DCHF-DA荧光探针检测细胞内ROS水平,采用相应试剂盒检测细胞SOD、GSH-Px及MDA的含量;免疫荧光法检测细胞DNA损伤、MTT结合流式细胞仪检测参麦注射液联合抗氧化剂NAC对HepG2和Hep3B细胞增殖和凋亡的影响。结果:1.细胞内ROS水平4、8、16、32mg/mL参麦注射液作用HepG2及Hep3B细胞24h,细胞内ROS阳性细胞数及ROS荧光强度随着药物处理浓度的升高而增大,与对照组相比有显著性差异,呈剂量依赖性,在32mg/mL参麦注射液处理组,HepG2及Hep3B细胞阳性率无明显差别。2.细胞内SOD酶活力4、8、16、32mg/mL参麦注射液作用HepG2及Hep3B细胞24h,两种细胞SOD酶活力与对照组相比均降低,但两者变化趋势略有差别,HepG2细胞SOD酶活力下降从8～32mg/mL浓度处理组有显著性差异,16mg/mL浓度SOD酶活力下降最明显,Hep3B细胞SOD酶活力下降在16、32mg/mL浓度处理组有显著性差异,32mg/mL浓度SOD达最低,其余处理组与对照组相比无显著性差异。3.细胞GSH-Px酶活力4、8、16、32mg/mL 参麦注射液作用 HepG2 及 Hep3B 细胞 24h,HepG2 细胞 GSH-Px酶活力下降在16、32mg/mL浓度处理组有显著性差异,32mg/mL浓度SOD活力下降最明显;Hep3B细胞的GSH-Px活力下降在8～32mg/mL浓度处理组均有显著性差异,其余处理组与对照组相比无显著性差异。4.细胞MDA水平4、8、16、32mg/mL参麦注射液处理HepG2及Hep3B细胞24h,所有药物处理组上清液中MDA水平与对照组相比均显著性升高;但两种细胞MDA升高趋势不完全相同。HepG2细胞的MDA水平随处理浓度的增加逐渐升高,与对照组相比均有显著性差异,但32mg/mL处理浓度与16mg/mL处理浓度相比MDA的数值并未相应增加。Hep3B细胞的MDA水平随处理浓度的增加而升高,呈现剂量效应。5.细胞DNA损伤(γH2AX焦点)4、8、16、32mg/mL参麦注射液HepG2 24h,随着参麦注射液处理浓度的增加,细胞内无焦点的细胞数量逐渐减少,从4～32mg/mL,无焦点的细胞数量从56%下降至9%左右,而焦点数量10～20及大于20个焦点的细胞数量则逐渐增加,32mg/mL的处理浓度,焦点数量10～20及大于20个焦点的细胞数量分别增加至32%及34%。Hep3B细胞在不同浓度药物处理后,表现出相似的趋势,无焦点的细胞数量逐渐减少,而焦点数量10～20及大于20个焦点的细胞数量则逐渐增加,32mg/mL处理浓度24h,焦点数量10～20及大于20个焦点的细胞数量分别增加至21%及28%。6.联用NAC对细胞存活率影响不同浓度参麦注射液单独处理HepG2及Hep3B细胞,细胞存活率随着药物浓度的增大而逐渐下降,32mg/mL处理24h,细胞存活率已分别下降至对照组的70%及50%左右。联用NAC后,参麦注射液对HepG2及Hep3B细胞的存活率的抑制效应均明显减弱,表现出相似的趋势,4、8、16mg/mL的药物处理组24h,细胞存活率与对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。但是32mg/mL的药物,联用NAC处理组细胞存活率与单独参麦注射液处理组相比明显升高,但是无法完全逆转参麦注射液对HepG2及Hep3B细胞存活率的抑制效应。7.联用NAC处理对细胞凋亡率影响参麦注射液单独处理HepG2及Hep3B细胞,随着药物浓度的增大,细胞凋亡率逐渐增加,32mg/mL处理24h,两类细胞凋亡率已分别升高至25%及42%左右。参麦注射液联合NAC处理对HepG2及Hep3B细胞的凋亡诱导效应均明显减弱,4、8、16mg/mL的药物处理组24h,细胞凋亡率与对照组相比,无显著性差异。但是32mg/mL的药物,联用NAC处理组细胞凋亡率与单独参麦注射液处理组相比有部分下降,但仍然高于对照组,说明NAC无法完全逆转高浓度参麦注射液对HepG2及Hep3B细胞的凋亡诱导效应。小结:参麦注射液在体外可以引起HepG2细胞和Hep3B细胞较强的氧化应激损伤和DNA损伤,达到一定程度时可激活诱导两种肝癌细胞凋亡。未发现参麦注射液所致氧化应激损伤与细胞p53基因缺失与否的关联性。第三部分 参麦注射液对肝癌细胞凋亡的信号通路的影响目的:以细胞株HepG2(p53非缺失)和Hep3B(p53缺失)为研究对象,探讨参麦注射液诱导肝癌细胞凋亡的分子机制。方法:流式细胞术检测参麦注射液作用HepG2和Hep3B细胞24h线粒体膜电位的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白P53、Caspase3、Caspase9、PARP及胞浆中Cytochrome c表达的影响。结果:1.细胞线粒体膜电位通过流式细胞术测定JC-1荧光强度反映线粒体膜电位变化,实验结果发现,8～32 mg/mL参麦注射液处理HepG2和Hep3B细胞24h,线粒体膜电位显著降低,且存在剂量效应关系。2.凋亡相关蛋白表达Western blot检测凋亡相关蛋白,参麦注射液处理HepG2及Hep3B细胞24h,细胞总蛋白裂解液中的蛋白前体Pro-caspase3、Pro-caspase9及Pro-PARP蛋白随着药物处理浓度的升高,表达水平逐渐降低,其活性剪切体Cleaved Caspase3、Cleaved-caspase9及Cleaved-PARP蛋白表达水平则显著升高。参麦注射液处理HepG2及Hep3B细胞24h,细胞胞浆中的Cytochrome c随着药物处理浓度的升高,表达水平显著增加。结论:参麦注射液可以通过p53依赖性和p53非依赖性途径诱导肝癌细胞凋亡。参麦注射液通过ROS爆发诱导了氧化应激损伤和DNA损伤,促发了 HepG2细胞和Hep3B细胞线粒体依赖性细胞凋亡途径。